[高三理化生]基因工程的基本操作1.ppt

* 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 基因的结构（补充知识） 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 ①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 ②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 ③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。 2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、 终止子），不编码蛋白质。 一、原核细胞的基因结构 二、真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 基因的结构（补充知识） 与RNA聚合酶结合位点 1、编码区 2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、 终止子），不编码蛋白质。 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 一、目的基因的获取 1、目的基因的来源 2、获取目的基因的常用方法 ①从自然界已有的物种分离 ②人工方法合成 ①从基因文库中直接获取 ②如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA ---基因组DNA文库（总） mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分） ②基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 ①基因文库的分类 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 1)基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库 cDNA(complementary DNA，互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库 2)cDNA文库 (cDNA library) 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 基因组文库与部分基因文库的关系 DUCK179制作 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢? 2.基因文库的构建方法 ①：直接分离法 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 受体细胞 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 (鸟枪法) 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 多用于原核生物 逆转录法 目的基因的信使RNA 目的基因 化学合成法 肽链氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 逆转录 2.基因文库的构建方法 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 ②人工合成法（真核生物） 推测 推测 单链DNA 合成 一、目的基因的获取 （二）利用PCR扩增目的基因 1、过程 高温变性（解旋为单链） 低温退火（引物与单链互补结合） 适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链） 重复循环 1、过程 一、目的基因的获取 （二）利用PCR扩增目的基因 一、目的基因的获取 （二）利用PCR扩增目的基因 2、条件 已知基因的核苷酸序列、 四种脱氧核苷酸、 引物 TaqDNA聚合酶 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 4、结果 耐高温 3、方式：以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数） 2n 适宜的温度和PH值 二、基因表达载体的构建 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 2、构建过程 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因等 1、基因表达载体的组成 想一想：其中有两个DNA片段连接形成的的产物有几种？ ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 三、将目的基因导入受