[生物学]DNA测序.pptVIP

* A+G反应 A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化，导致糖苷键被削弱，在吡啶存在时，嘌呤环被吡啶取代，吡啶在加热条件下导致DNA链嘌呤位点（A或G）发生断裂。 * G+T反应 G+T反应：肼能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落，在吡啶存在时，导致被修饰碱基处的DNA断裂。 * C反应 C反应：在一定浓度的NaCl条件下，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被吡啶置换。 * DNA序列的自动测序 全自动DNA序列原理与Sanger双脱氧末端终止法相同。 所不同的两点：一是标记物不同，手工测序采用放射性核酸标记，自动测序采用的是4中荧光染料，这4种荧光染料分别暴击不同的终止物ddNTP或标记物，将这些标记物分别加到不同的反应管中，经Sanger测序反应后，产物3’端（标志终止物ddNTP ）或5’端（标记引物法）带有不同荧光标记，一个样品的4个序列可以在一个泳道内电泳，从而降低了序列泳道间迁移率差异对精确性的影响。 * 二是检测手段不同，手工测序采用放射自显影，从4种末端寡聚核苷酸的梯子形图谱中，直接读出DNA序列，而自动测序则经电泳将各个荧光谱带分开，同时激光检测器同步扫描，一次扫描可检测出多种荧光，不同荧光代表不同的碱基信息，传入电脑，其速度高达200bp/h。 自动测序仪连续采集的数据在计算机中储存并迅速加以处理，结果清晰准确，分辨率高，操作人员可以根据显示屏上的彩色显示图像准确分辨出某一DNA样品的碱基排列顺序。读序时，根据计算机软件中碱基的代表符号，进行阅读和编辑。 * DNA的化学合成 * DNA合成方法有液相磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后两者基础上发展起来的固相的磷酸三酯法和亚磷酸三酯法及自动合成法。 从原则上讲，任何大小的基因和核酸片段都可用化学方法合成。对大分子量的基因而言，直接从生物体中分离天然的基因则比较适宜。 人工合成的基因可以使生物体内已经存在的，也可以是按照人们的愿望和特殊需要重新设计的。 因此，它为人类操纵遗传信息、校正遗传疾病、创造新的优良物种提供了强有力的手段，是基因研究的一个富有成就的重大飞跃。 * DNA化学合成的原理 磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 用寡核苷酸片段组装基因方式 * 磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 磷酸三酯法和磷酸二酯法一样，包括单体的制备、缩合和分离纯化等。 它们都使用了再单核苷酸的5’末端或3 ’末端加保护基团的做法，以防止在这两个末端之间形成磷酸二酯键。 但在磷酸三酯法中，参加缩合反应的单核苷酸，是一种核苷3 ’—单磷酸的衍生物。 在它的磷酸分子上有一个羟基（P-OH）已经带上了适当的保护基团（通常是邻氯苯基和对氯苯基），因此事实上已经是一种磷酸二酯，而余下的另一个P-OH仍然具有反应活性，可以同另一个带有3 ’末端基团之单磷酸的5’-OH缩合形成具磷酸三酯键的二核苷酸分子。 * 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 固相亚磷酸三酯法，是目前最通用的一种合成寡核苷酸的方法。 合成的一盒循环周期分为以下4歩： 1.保护。用酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团 偶联的保护基团DMT。在这种脱DMT反应中，通常的酸是二氯乙酸（DCA）或三氯乙酸（TCA）。 * 2.偶联反应。通过一种弱酸——四唑（tetrazole）的催化反应，使加进来的第二个核苷酸（N2）同已附着在固相载体上的核苷酸1之暴露的5’-OH基团缩合。 3.封端反应。由加入的乙酸酐（acetic anhydride）激发的乙酰化作用，把所有的没有参与偶联反应的5’-OH基团全部封闭起来。 * 4.氧化作用。在核苷酸N1和N2之间新形成的3’，5’-亚磷酸三酯键十分活跃。利用碘液催化作用，使之被氧化成为相当稳定的3’，5’-磷酸三酯键。这也就是为什么称这种寡核苷酸合成法为亚亚磷酸三酯法的原因。 在下一个合成循环之前，要把附着在最后一个偶联核苷酸上的二甲氧基三苯基（DMT）移去，以保证它的3’-OH基团能够暴露出来，同一个活化的脱氧单核苷酸溶液进行偶联反应。 DMT是一种显色指示剂，所以它的释放可用来检测偶联反应的效率。 * 上诉这种循环反应，可被重复进行，直到合成具有所需序列长度的寡核苷酸片段为止。到合成终止时，固相载体上携带着被完全保护的寡聚脱氧核苷酸，因此需要使它们有系统地去掉保护基团，并从固相载体上释放出来，成为游离的寡核苷酸。 然后，用乙醇沉淀法纯化这些寡核苷酸，再用高效液相色谱法或凝胶电泳法使之进一步纯化，并同未完成的较短的片段分开，最后得到真正需要的产物。 * * 用寡核苷酸片段组装基因方式 常用的组装基因的方法有两种： 第一种方法是先将寡核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基团，然后再与相应的互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片