实验五 蟾蜍催青及人工受精.ppt

（一）催青及人工授精 （二）胚胎发育 （三）胚胎细胞的分离和再聚集 作 业 电子版上交蟾蜍、受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、尾芽期 各期照片；胚胎去膜前后以及分离细胞、聚集细胞的照片； 以表格的形式提交蟾蜍胚胎及幼虫的发育时序（注意水温），并绘制 蟾蜍卵裂期、原肠胚和神经胚的外形图； 思考：催青的原理 * 一、目的要求 掌握蛙或蟾蜍的催青的原理； 熟悉蛙或蟾蜍的催青及人工受精的操作技术； 通过活体观察蛙或蟾蜍各发育阶段的形态变化，加深对发育连续时空变化的理解，建立蛙胚早期发育的形态模式； 了解胚胎细胞分离和再聚集的原理和操作 二、实验材料 蟾蜍 Bufo sp. 三、实验内容 （一）催青和人工授精1、催青 雌：75 mm，雄：70 mm 保存于冰箱中（4 ℃左右），1周左右后取出，提高水温至18～20 ℃，注射激素，24 h内观察是否抱对产卵（22℃）。 腹腔注射 雌体： LHRH（黄体生成素释放激素）/ LRH-A：3～5 μg/只 hCG（人类绒毛膜促性腺激素）：20～30国际单位/只 或垂体提取液： 3～5个/只 雄体：注射量减半 2、人工授精 解 剖 取 精 巢 制 备 精 子 悬 液 剪碎后加适量生理盐水（0.7％），搅匀 获 取 卵 子 左手握住即将产卵的雌蛙，腹部向上，右手拇指或食指由前向后轻轻挤压腹部，卵即可由泄殖孔流出 人 工 授 精 10～15 min后经几次换水后，加入足量清水，孵化期间每天换水1-2次。 培 养 把挤出的卵收集在培养缸内（每毫升水中3～5个卵，20 ～ 25℃），加入精子悬液摇匀 （二）胚胎发育 1-6期：5次卵裂 受精卵～32细胞期 观察并记录各发育阶段的胚胎； 滤纸去除卵外胶膜 7期：囊胚早期，桑椹状 8期：囊胚中期，表面平 整，细胞界限可分辨 9期：囊胚晚期，细胞界限不清至背唇出现，色素冠向植物极延伸 10期：原肠早期，月牙状原口沟至呈马蹄状 11期：原肠中期，呈马蹄状原口沟至胚孔形成 12期：原肠晚期，期卵黄栓由大变小至胚孔封闭 原肠晚期 13期：神经板期 14期：神经褶期 15期：胚体转动期（神经沟期） 16期：神经管期 17期：尾芽期 18期：肌肉效应期 19期：心跳期 20期：鳃血循环 神经沟期 神经管期 21期：开口期 22期：尾血循环 23期：鳃盖褶期 24期：鳃盖右侧闭合期 25期：鳃盖全闭合期 26期：鳃盖闭合完成 （三）胚胎细胞的分离和再聚集 囊胚晚期/原肠胚早期胚胎 消毒（70%ALC，5 sec） Steinberg 溶液洗涤 用吸管将胚胎移入分离溶液（2-3ml 无钙、镁的Steinberg溶液）中，数分钟内胚胎细胞即开始分离，辅助：镊子拨动或吸管吹打 解剖镜下剥离胶膜、卵黄膜 先除胶膜，再去卵黄膜 分 离 胚 胎 细 胞 （手术皿中进行） ① 胚胎细胞的分离 拍照去膜前后胚胎、分离胚胎细胞 （三）胚胎细胞的分离和再聚集 Steinberg 溶液中清洗 再聚集液中培养 从培养开始后的几小时内，观察再聚集过程。再聚集时期，细胞群体有时形成线状或链状细胞群，当1团光滑的、色深的细胞群形成时，聚集完成 吸管收集分离细胞，移至新的Steinberg中（如同细胞转移的分离液很少，可直接移至再聚集溶液中 镜 下 观 察和 拍 照 ② 细胞培养和再聚集观察 拍照胚胎细胞聚集前后的照片 * *