第16章.同位素示踪在植物病理学研究中的应用教案.pptVIP

操作程序 制备受体材料（组织、单细胞液） 配基 孵育 分离B 与F 测定 作Stcatchard图(B/F—B) * 参考文献 1)张 良,放射性配基结合分析对不同细胞uPAR表达的比较研究,上海第二医科大学学报,2000，20（2)：102~104 2)崔毓桂 , 红细胞胰岛素受体分析法的改良及其初步应用,， 标记免役分析与临床, 1996，3（4）：185~188 3)王雨田, 消化系肿瘤细胞EGF受体放射分析 与 EGF的生长调节研究,第四军医大学学报,1996,17（5）： 336~339 4) 匡安仁 , 125I-G018 动物体内受体结合研究, 华西医大学报，1994，25（2） ：131~133 * 4.3mRNA差示显示技术 病原微生物侵染寄主,将启动寄主基因选择性表达,利用mRNA差示显示技术，可以鉴别出与对照表达有差异的基因，进而在分子水平上研究植物致病的病理或生理变化过程。mRNA差示显示原理如下：所有mRNA的3’端都有一个Poly（A）尾，因此，利用 3’端 引物 T12MN，即在OligodT后接2个选择碱基，M可能为（G 、C 或T）三种，N可以为（G、Ｃ、Ｔ或Ａ）四种，共十二种组合，每种覆盖1/12mRNA,通过反转录将把mRAN群体反转录为１２个个别的cＤＮＡ亚群。然后用一个 5’端任意引物对每个cＮＤＡ亚群进行ＰＣＲ扩增。 * 在扩增时，可以掺入３５S标dＡＴＰ或dＣＴＰ或其它标记，经测序胶电泳(分辨500bp)，对?光片暴光，可以鉴别出对比材料中有差异的DNA片段，将其从胶上切下，再扩增进行克隆分析，就能从cＮＤＡ文库或基组DNA文库筛选到全长cＮＤＡ或基因克隆.。该方法较传统差异法有巨大的优势,但要使15000种mＲＮＡ均可扩增，考虑测序胶能显示50多个带，则需至少20个引物，进行12×20次组合PCR，工作量很大，通过对Ｔ１２ＭＮ.简并和提高测序胶的容量 ,该法已有实用的试剂盒。 * 对照组织/细胞 处理组织/细胞 总RNA(少量） 总RNA(少量） Oligo dT12MN cDNA cDNA PCR扩增 5‘端随机引物，35S PCR产物 PCR产物 变性测序胶 电泳 对照 处理 取下差异带 再次PCR 制备探针 Sorthern,检索 cDNA文库，基因 * 4.4 病理代谢研究 试验证实，植株感病部位代谢活动较正常部位更为活跃,通过离体培养并饲喂放射性核素或标记前体,检查其惨入代谢物的过程,可进行病理代谢研究。Darokher(1983) 将患病TMV烟草叶片下表皮, 在含3.7MBq/ml 3H-尿苷中温育3h ，下表皮经磨碎、抽提、 过滤、离心等纯化,发现患TMV叶片有3H标记核蛋白,其浮力密度为1.23—1.45g/cm3, 放射性出现一至数个峰值,这说明TMV专 化性核蛋白很高，推断TMV作用在寄主的核蛋白上。 * §5.分子标记在植病研究的应用 5.1分子标记类型 分子标记是以DNA多态性为基础，以相应的DNA顺序片段为测度的遗传标记,是继形态标记、胞标记和生化标记后的一种新的标记,是联系遗传图谱和和物理图谱的桥梁，也是继分子杂交，PCR之后迅速兴起并广泛应用的重要生物学实验技术。 生物多样性 DNA多态性 顺序片段 分子特征图谱。 *