[生物学]分子生物学实验.pptVIP

一、PCR的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 （一）PCR技术的基本过程 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling): 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″ 3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 5? Primer 1 5? Primer 2 5? 5? Template DNA PCR技术原理 Cycle 3 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。 二、PCR反应体系：终浓度 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 2、MgCl2: （1.5～2.0mM） Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 3、dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物（0.02～0.2 mM） dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，但增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 4. 引物 (Primer-P)：（0.2 ～ 1 μM） 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低 6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低 7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 PCR反应体系： 常用30μl，各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。 10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl MgCl2: 1.5×30 / 25 = 1.8μl dNTPs: 0.2×30 / 10 = 0.6μl 引物 P： 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl Taq 酶(5U/μl)： 1/5 = 0.2μl 模板： 1