[生物学]流式细胞仪_大学课件.ppt

不同分选系统 信号检测 液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射后,我们可以接收到两种光信号. 第一种 散射光 受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关. 第二种 荧光 荧光染料在激光的激发下,发荧光可显示出研究对象的相关信息.荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。 在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量 FSC forward scatter light (“fsc”) or forward angle light scatter (“fals”). 小角散射又称前向角散射光光它反应细胞的相对大小和截面积的大小,一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系 ； SSC side scatter light (“ssc”) or 90° light scatter. 侧向角散射又称90度角散射光代表细胞的颗粒度和精细结构的变化. FSC SSC 荧光 Laser 全血细胞流式FSC-SSC图 红细胞 白细胞 血小板及死细胞 单核细胞 信号检测--荧光信号 自发荧光 特异荧光 特异荧光 能量级 激发 激发态 发射 激光 能量损失 荧光及发光原理 荧光的产生 一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。 荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。 可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。 寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf 为106~109s-1。 荧光物质 荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：　　 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490 ～ 495nm，最大发射光波长520 ～ 530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。 其他荧光物质 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 数据显示类型 单参数直方图（Histogram） X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系 Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率 二维等高图和密度图 Pseudo 3D Plot 3D Plot 二维点图Dot Plot 便于数据统计 不同的细胞群可以用不同的颜色标记 主要表达方式 光谱交叉 Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780 FITC