[农林牧渔]核酸分子杂交.ppt

八、脱探针的方法及注意事项 ： 尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定保持湿润。 处理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100℃ 5－10分钟 DNA的膜还可以用0.2N NaOH处理 九、标记的方法 1、缺口平移法 （Nick Translation） 原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 3、末端标记 * 核酸分子杂交 一、概念： 1、分子杂交（hybridization) :有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。 2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体支持物上的过程。 3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。 4、种类： 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 液相杂交（solution hbridization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。 DNA与DNA杂交 DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交 5、几种常见的杂交： 分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：　　(1) Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。　　(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 二、Southern杂交 1、步骤： Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。　　(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。　　(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。　　(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。　　(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。 Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。 2、固体支持物的种类： 带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜 尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。 尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。 尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋