第十八章_高效液相色谱法.pptVIP

第十八章高效液相色谱法 一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC区别 三、HPLC主要类型和原理 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1、经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀；常压输送流 动相；柱效低（H↑，n↓）；分析周期长；无法在线检测 2、HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱）； 高压输送流动相；柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩 短；可以在线检测 二、HPLC与GC区别 1、分析对象差别 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2、流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相；可以增大分离选择性 3、操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、HPLC主要类型和分离方法 1）溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2）固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质 的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大 3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱 碱k变小。 分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用 分离选择性： 极性强的组分k大，后洗脱出柱。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。 第十八章高效液相色谱法 一、化学键合相色谱法固定相 二、化学键合相色谱法流动相 三、分离条件的选择 一、化学键合相色谱法的固定相 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； －用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。 （2）弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 （3）极性键合相： 常用氨基﹑氰基键合 相（氰乙硅烷基 ≡Si(CH2)2CN)键合 硅胶，一般用于正 相色谱 2、键合相的性质和特点 （1）键合反应 硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 （2）键合相的性质 含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 （3）键合相的特点 使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高；重现性好；适于梯度洗脱；载样量大 二、化学键合相色谱法的流动相 注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相) 1、流动相对分离的影响 n：由色谱柱（固定相）性能决定， α：主要受溶剂种类的影响， k：受溶剂配比的影响。 注意：对于非电离的溶剂，在正相色谱中溶剂的 强度和极性是同义词。这样强溶剂或极性溶剂能 溶解极性的溶质，并使溶质在较小的k值下流出。 在反相色谱中溶剂极性和使溶质从柱内流出的能 力之间的关系正好相反。如水是强溶剂，但在反 相色谱中，它使溶质流出的能力是极小的，水中 必须加上有机溶剂才能使溶质在反相色谱柱上在 适当的k值下流出 三、分离条件的选择 1、HPLC中的速率理论 涡流扩散　A=2λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 纵向扩散　β=2γDm 可以忽略。 因为Dm很小，室温操作，且U大于U最佳， －传质阻抗：（