蜗牛酶提取新生隐球菌基因.docVIP

蜗牛酶提取新生隐球菌基因组 一、试剂准备 1 巯基化合物(0.04M EDTA和0.14M β-巯基乙醇)（30ml）： 0.5M EDTA 2.4 ml 巯基乙醇（分析纯ρ=1.11439g/ml） 294 μl 无菌水 27.3 ml 在通风橱中操作，将三者加入50ml离心管中，涡旋震荡混匀，用膜封口，4℃保存。 2 蜗牛酶的溶解： 1） 1g市售蜗牛酶（用前4℃保存）。 2） 配置pH5.8的磷酸钾缓冲液（100ml）： 1 mol / L K2HPO4 1 mol / L KH2PO4 8.5 ml 91.5 ml 3） 配置SCPB缓冲液（10ml）：1.82g山梨醇、0.042g柠檬酸钠，用10ml pH5.8磷酸钾缓冲液溶解，涡旋震荡混匀，在超净台中，滤器过滤除菌，4℃保存。 4） 超净台中，将5ml SCPB缓冲液加入到装有1g蜗牛酶的棕色瓶中，轻轻摇动混匀，务必使蜗牛酶完全溶解，用之前用枪头挑一下瓶底，看是否有未溶解的酶，若有则继续摇动或用枪头吹吸之溶解。溶解后的蜗牛酶成为200mg / ml的溶液，4℃保存。 3 SE缓冲液（30ml）： 1.5M NaCl 3ml；0.5M EDTA（pH8.0） 6ml；无菌水 21ml。超净台中配置。涡旋混匀，4℃保存。 4 Ⅱ液（30ml）： 0.5M EDTA（pH8.0） 1.2ml 1M Tris-Cl（pH8.0） 1.5ml 无菌水 27.3ml 超净台中配置。涡旋混匀，4℃保存。 10% SDS（30ml）：30ml无菌水溶解3g SDS，涡旋溶解，无需灭菌，常温静置。 5M KAc（30ml）：30ml双蒸水溶解14.73g乙酸钾，高压灭菌， 4℃保存，使用前20min置于-20℃冰箱预冷。 氯仿-异戊醇（24:1）（12.5ml）：12ml氯仿与0.5ml异戊醇混合均匀，用膜封口，4℃保存。 异丙醇（-20℃）；70%乙醇（-20℃）；无菌水（4℃） 二、实验步骤 接菌环挑取一环菌体，接种于液体SDA培养基中，37℃，200转摇培48-72h，准备菌液。实验前准备32℃、65℃水浴和冰盒。 1、3-5ml菌液分次加入1.5ml离心管中，室温10000rpm离心1min，弃上清。 2、200μl无菌水洗涤菌体（吹吸重悬），室温10000rpm离心1min，弃上清。 3、重复步骤2一两次 4、用巯基化合物预处理菌体，以提高蜗牛酶作用效果：菌体悬于300-500μl巯基化合物中，32℃水浴15-30min。期间轻轻颠倒离心管两三次。 5、室温10000rpm离心1min，弃上清。 6、用500μl SCPB缓冲液悬浮菌体，加入100μl蜗牛酶溶液，32℃水浴40min，期间轻轻颠倒离心管五六次。 7、室温13000rpm离心2min，弃上清。 8、500μl SE液洗涤沉淀，将其吹打悬浮，室温10000rpm离心1min，弃上清。 9、重复步骤8五六次。 10、加500μlⅡ液和50μl 10% SDS，吹打混匀，65℃水浴30min，期间轻轻颠倒离心管两三次。 11、加200μl 5M KAc溶液，冰浴30min。 12、4℃，12000rpm离心15min。将上清转移新离心管中，计量上清体积。 13、加等体积氯仿-异戊醇，剧烈震荡，4℃，6000rpm离心10min，将上清转移至新离心管中。 14、重复步骤13一次，计量上清体积。加等体积冷异丙醇，-20度静置10min 15、4℃，13000rpm离心10min，弃上清，此时管底应有白色沉淀，用70%冷乙醇洗涤沉淀2-3次，尽去残液，室温晾干沉淀。 16、30-50μl无菌水溶解沉淀，-20℃保存。