TRAIL所引起细胞凋亡作用在人类肿瘤细胞株之研究.docVIP

PAGE 2 PAGE 1 TRAIL所引起細胞凋亡作用在人類腫瘤細胞株之研究 指導教授：台大醫學院免疫學研究所 許秉寧 教授 指導老師：薛如娟 老師 作者：趙悅伶 一、研究動機 新世紀的疾病「癌症」在國內外十大死因中居高不下， 而目前的治療方法效果不顯著且常造成人體其它組織的傷害， 這是個棘手問題， 人們往往聞之色變； 若是能找到一種方法， 能有效殺死癌細胞而不對正常細胞造成傷害， 將十分有益於癌症的治療。 有鑑於此， 我們希望藉由計畫性細胞死亡的方式， 結合免疫的知識， 達到上述的目的。 記得在雜誌上看過， 近年來發現了一個TRAIL ﹝TNF (Tumor Necrosis Factor) Related Apoptosis Inducing Ligand﹞分子， 可以導致細胞的「計畫性死亡 (apoptosis，或稱作細胞凋亡)」， 且對於腫瘤細胞特別敏感； 而「計畫性死亡」的特徵乃 (1)核皺縮 (2)DNA斷裂 (3)細胞萎縮而不破裂， 相較於另一種死亡 (Necrosis，壞死) 的死亡方式來說， Apoptosis不會造成人體過度的發炎反應， 十分符合我們的條件。 基於這些原因， 我們便想培養不同的人類腫瘤細胞株， 測試TRAIL對其造成計畫性細胞死亡的敏感度， 以作為日後癌症治療研究發展的基礎； 並進一步以RT-PCR方式定性分析各種腫瘤細胞株中 TRAIL及 TRAIL受體的表現情形， 並和人類正常細胞作一個比較， 以了解人類腫瘤細胞株對於 TRAIL 的敏感度和其 TRAIL 及 TRAIL受體的表現之間的關係。 二、研究摘要 腫瘤壞死因子及其受體 (TNF/TNFR) 分子族群蛋白成員在許多生物系統中的細胞凋亡 (apoptosis)， 或稱做設定性死亡反應上， 扮演著非常重要的角色。 TRAIL (又被稱做Apo-2 ligand) 是這群蛋白分子中屬於TNF配體 (ligand) 的新成員， 它具有引發多種轉型細胞株進行細胞凋亡的能力。 在1997年有幾種人類TRAIL分子的受體 (receptor) 被發現， 且都屬於TNF受體分子族群中的新成員， 其中TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5分子具有死亡小區 (Death domain)， 可傳遞TRAIL分子引起的細胞凋亡訊息； 而TRAIL-R3/DcR1不具有死亡區域其及TRAIL-R4/DcR2只具有不完整的死亡區域， 得這兩個分子可以在生體外抑制TRAIL分子所引發的細胞凋亡作用。 由於TRAIL具有引發廣泛的細胞株凋亡的能力， 但又不會引起正常的細胞凋亡， 而TRAIL受體在腫瘤組織上的表現與TRAIL在腫瘤清除中的角色並不是相當清楚， 所以在此研究中我們培養不同的人類腫瘤細胞株， 測試其對於 TRAIL 的敏感度， 並且以 RT-PCR 的方式進一步探討 TRAIL 受體的表現與其敏感度之間的關係。 我們將各種人類腫瘤細胞株取出後計算細胞數， 將大約 104/100 ?l濃度的細胞養在96孔培養盤上， 培養隔夜後， 將培養基移除， 置換為含有經序列稀釋 (series dilution) 的重組蛋白質的培養基， 實驗中包含加入濃度自1500、750、375、187.5到93.75 ng/ml序列稀釋的重組蛋白質， 以及沒有加重組蛋白質的控制組， 將細胞再培養24小時後， 以結晶紫染色法分析細胞凋亡的情形。 分析的結果中， 其中 Hela、HA22T 及 Mahlavu 細胞株對TRAIL比較敏感， 加入重組蛋白濃度達到1500 ng/ml時， Hela可以見到約有50.3% 的細胞凋亡、 HA22T 有高達約80~82% 的細胞凋亡、 Mahlavu 可以見到有 55.3% 的細胞凋亡； 而細胞株 Sk-Hep-1 的凋亡比率低於 20%， 人類B淋巴瘤細胞株 DG75對於TRAIL幾乎沒有反應， 且隨著 TRAIL濃度的提高並不會引起較多的細胞凋亡， 顯示這些細胞株對TRAIL是具有抗性的。 為了要進一步研究各種人類腫瘤細胞株對於 TRAIL 敏感性是否由於它們表現 TRAIL 受體的不同所影響， 我們以 RT-PCR的方式測試各細胞株中 TRAIL及 TRAIL-R的表現。 我們將各種人類腫瘤細胞株培養於 medium中， 在其生長旺盛時取細胞至少 1 ×106