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GFC的不足之处在于 ： 仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小； 经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。 凝胶过滤特点 原理与操作 IEC的应用 特点 ㈡ 离子交换层析 8.3 层析方法介绍 原理与操作 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法； 阴离子交换基有DEAE，QAE；阳离子交换基为CM，P和SP。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TSKgel PW、Bio—Gel和纤维素等。 ㈡ 离子交换层析 洗脱时采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(linear gradient e1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(stepwise elution)。 小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模放大，而必须实施必要的探索性实验。 ㈡ 离子交换层析 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： 其中I为流动相的离子强度，A和B为常数，m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。对于不同的溶质，式中的常数A和B不同，即在离子交换剂上的分配行为不同，因此在洗脱过程中彼此之间得到分离。 ㈡ 离子交换层析 线性梯度洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于洗脱的溶质在较小的流动相体积下洗脱。显然，通过改变流动相离子强度的增大速度(即浓度梯度)，可调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰之间的距离，在改善分离度的同时缩短洗脱时间。 ㈡ 离子交换层析 逐次洗脱过程中，流动相的离子强度阶跃增大，因此溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。如果流动相离子强度的阶跃速度很快，逐次洗脱就接近了线性梯度洗脱；反之则接近恒定洗脱。因此逐次洗脱是介于恒定洗脱与线性梯度洗脱之间的一种洗脱法。 ㈡ 离子交换层析 在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。层析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次沉脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。 ㈡ 离子交换层析 IEC的应用 IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性，而且选择性远高于GFC。 ㈡ 离子交换层析 特 点 料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； 应用范围广泛，通过优化操作条件可大幅提高分离的选择性，所需柱长较短； 产品回收率高 ； 商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂 。 ㈡ 离子交换层析 原理 疏水性吸附剂 操作 特点 ㈢ 疏水层析 8.3 层析方法介绍 基本概念 3.洗脱体积VR ：溶质达最大浓度时，已流出的流动相体积， VR＝Vm＋kdVs 滞留时间：溶质流出色谱柱所需的时间 tR＝VR/Qe t0＝Vm/Qe Qe:洗脱剂的流量 t0：死时间 基本概念 4.容量因子k ：是固定相和流动相溶质数量之比 容量因子是吸附剂对溶质亲和力的量度，k越低，从柱中流出的越早 基本概念 5.选择性α： α＝kd1/kd2 6.分离度（分辨率）Rs：表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。为提高溶质之间的分离度，可以采用增大峰间距离或降低峰宽的方法。 分 离 度 柱色谱系统的组成 色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成(下图)。 柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成： A 蠕动泵 B 层析柱 C 装柱 D 加试样 E 洗脱 F 检测器 G 部分收集器 柱层析系统的组成 柱层析装置图 缓 冲 液 管 柱 梯 度 制 造 器 监 视 器 记录器 分 划 收 集 器 (1) (2)泵 (3) (4) (5) adaptor reservoir 胶 体 装 填 胶 体 A 柱层析的基本操作 ⑴ 装柱： 要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱 根据层析的基质和分离目的选柱子。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。