PCR基本原理.pptVIP

* * * * * * 聚合酶链反应及其它扩增技术 　　 中南大学湘雅医学院医学检验系　徐克前 DNA复制过程 一、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） (一) 定义：利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下， 　　　　　 催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技 术。 　　 引物：单链DNA片段 　　 过程：① 变性（denaturation）：DNA双链→单链（93－98℃） 　　　　　 ② 退火（annealing）：引物与模板结合（37－65℃） 　　　　　 ③ 延伸（extension）：双链合成（70－75℃） 　　 PCR扩增效率： 　　　　　 Y＝A（1＋E）n 　　　　　 式中：Y产物量；A靶DNA量；E扩增效率；n循环次数 　　　　　　 当E＝100%时，n＝25，Y＝225，A 　　　　　　 当E＝90%时，n＝25，Y＝1.925，A＝9307649A 　　　　　　　　仅是前者的28% 平台效应：PCR经一定的循环后，不再呈指数增长，而是进入线 性或静止期，此过程称为平台效应。 原因：① 引物、dNTP浓度逐渐降低 　　　　　② 酶与模板的比例下降 　　　　　③ 非特异性产物或引物二聚体与反应物竞争 　　　　　④ 产物的再结合 二、影响PCR的因素 (一) 模板核酸：DNA或RNA→cDNA 　　　　　　　 模板量的多少合适 (二) 引物：特异性的关键 　　　　　 浓度0.1-0.5μmol/L 　　　　　 过高：错误引发，导致非特异性产物堆积；形成引 　　　　　　　　 物二聚体。 　　　　　 过低：导致扩增产量下降。 (三) 缓冲液：为Taq DNA聚合酶提供最适酶反应条件。 　　　　 常用10－15mmol/L Tris-HCl Taq DNA聚合酶时Mg2+、K+、NH4+敏感 　　　　 稳定酶的物质：牛血清白蛋白或明胶或Tween20及DTT (四) Mg2+：Taq DNA聚合酶必需 　　　　　过高：非特异性扩增产物的累积 　　　　　过低：酶活力降低 (五) dNTP：50－200μmol/L 　　　　　 过高导致错误渗入；过低导致假阴性 (六) 耐热DNA聚合酶：1－25U/100μl 　　　　 过高出现非特异性扩增；太低扩增产物产量降低 (七) 温度和循环参数 　1. 变性温度和时间：95℃　30秒 　　　　 温度高、时间长、变性越充分；但影响酶的活性 　2. 复性温度与时间：55℃ 　3. 延伸温度与时间：72℃ 　4. 循环次数： 三、PCR扩增产物的分析法 (一) 凝胶电泳分析法：琼脂糖或PAGE (二) 点杂交：将扩增DNA固定到NC上，再用探针杂交 (三) 微孔板夹心杂交法 (四) PCR－ELISA法 (五) 荧光探针标记法 四、常见PCR技术的类型 (一) 原位PCR (二) 逆转录PCR（RT－PCR）及定量RT－PCR (三) 反向PCR (四) PCR－SSCP (五) PCR－ELISA (六) 固相锚定PCR (七) mRNA差异显示逆转录PCR 五、PCR的应用 (一) 在感染性疾病中的应用 　1. 应用范围： 　⑴ 对传染性疾病进行病原学确证诊断 　⑵ 对病原体进行基因分型和同源性比较 　⑶ 克隆病原体各种蛋白质的基因，用于蛋白表达，制备诊断试 　　 剂或疫苗 　⑷ 发现新的病原体 　⑸ 克隆病原体各种基因，建立基因表达载体，用于基因治疗 2. 优缺点： 　 优点：⑴ 灵敏度高，HBV　PCR　100copies/ml ⑵ 特异性强，20个核苷酸的引物，非特异性配对概率1/420 血清学诊断有交叉反应 　　　　 ⑶ 早诊断，HCV感染，1周内可检测出HCV RNA 　　　　　　 2周后，可检测出抗体 　　　　 ⑷ 适用于免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者 　　　　 ⑸ 对病原体可定量分析，反映动力学变化 　 缺点：⑴ 操作复杂 　　　　 ⑵ 价格昂贵 　　　　 ⑶ 易造成假阳性、假阴性结果 (二) 遗传性疾病的基因诊断 　　　　 发现的遗传病有4000多种；产前诊断 　　　　 PCR－RFLP；PCR－ASO (三) 肿瘤的研究及诊断 　　　　 癌基因与抑癌基因 (四) 在法医学中的应用 　　　　 个人认识；亲子鉴定 (五) 其它应用 　　　　 DNA克隆；引入点突变、缺失或插入；重组PCR； 　　　　 DNA测序；差示PCR 六、PCR假阳性或假阴性的预防和对策 (一) 对产物污染的预防：包括Pre