质粒大抽protocol(用QIAGENMaxiColumn).PDFVIP

中国生命科学论坛杂志TILS, Trends In Life Sciences 质粒大抽 protocol(用 QIAGEN Maxi Column) 2003/4/28 陈俊 1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到 3ml 选择性培养基，摇床培养 14 小时,225 rpm 。 2. 从小量培养物中取 1ml 用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的 培养物，以 1：1000 接种到 100 ml 选择性 LB 培养基中，摇床培养 14 小时,225 rpm 。 3. 从大量培养物中取 700 微升菌液和 300 微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过 夜后，放入-70℃冰箱中。并且在 stocklist 中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的 上方) 。 4. 把 100ml 的菌液倒进250ml 离心管中，4 ℃离心，6000g 离心 15 分钟（No41 rotor 8500 rpm ）。 5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入 4ml 4 ℃预冷的细胞重悬液 buffer P1 （确 定是否加了 RNase ）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。然后将悬浮液转到 50ml 的离心 管中。 6. 加入 4ml 细胞裂解液 buffer P2 ，彻底而且轻柔地颠倒混匀 4-6 次，在室温下孵育不要超 过 5 分钟 （从开始加 P2 时计时，时间太长会使质粒DNA 断裂）。样品不要斡旋，buffer P2 用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的 CO2 酸化。 7. 加入 4ml 预冷的 PH 调节液 buffer P3, 及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀） 地颠倒混匀 4-6 次，在冰上孵育 15 分钟。后再一次混匀样品．20000g ，4 ℃离心 30 分钟 （N046 rotor 18000 rpm ）.若上清不够清需再离心 15min. 此步可对上清取样 240ul （sample 1 ）以备检测分析 8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用 buffer QBT 润湿纱布。用 4ml 的buffer QBT 来平 衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。（正常情况8min 可以流完） 9. 然后把 7 中的上清小心吸到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。此步可取 样 240ul （sample 2 ）以备检测分析 10. 用 5ml buffer QC 清洗层析柱一次，去掉纱布（去掉前，建议戴一次性手套挤一挤或用 枪头挤一挤），再加一次 5ml buffer QC 清洗层析柱。此步可取样 400ul （sample 3 ）以备 检测分析 11. 用 8-10ml buffer QF 洗脱 DNA,用两只 10ml 的离心管分别收集洗脱液。此步可取样 20ul （sample 4 ）以备检测分析；同时可再加 5ml buffer QF 洗柱，洗柱液保存至实验结束 （sample 5 ）以备检测分析，接着按清洗方案洗柱。 12. 在两管洗脱液中各加入 0.7 倍(5 ×0.7=3.5 ml)体积的室温的异丙醇沉淀 DNA,并在沉淀会 出现的位置做标记，离心前一定要蜗旋（vortex 8.5 ） 然后在 4 ℃,15000g 离心 30 分钟 (No26 rotor 14300 rpm),取出时保持管平行移动，小心的倒去上清.注意:不要将沉淀倒掉. 13. 用 2ml 室温的 70 ％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀盐及置换异丙醇), 4 ℃,15000g 离心 10 分钟 (No26 rotor 14300rpm), 取出时保持管平行移动，小心倒掉上清. 注意:不要将沉淀倒掉. 更高要求时可再一次用乙醇清洗． 14. 在空气中干燥沉淀 5-10 分钟,用合适体积的 TE （一般500ul ）溶解沉淀.