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悬浮细胞染色体标本的制备 动物染色体Gimsa分带 人类姐妹染色单体色差分析 细胞生物学大实验 细胞生物学大实验 细胞生物学大实验 人染色体Gimsa分带技术及姐妹染色单体色差分析技术 悬浮培养细胞染色体标本制备 实验背景 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞或血液系统来源的细胞，如血液细胞和某些癌细胞（HL60）。特点是细胞不再受接触抑制的限制，生存空间大，细胞繁殖的数量多，传代方便，易于收获。 在动物细胞染色体研究的历史中，有三大关键技术：一是秋水仙素的应用；二是低渗技术；三是植物凝集素（PHA）的应用。PHA可以刺激淋巴细胞转化成淋巴母细胞，重新进入分裂期。上述技术的出现，使得通过培养外周血细胞来制备人体与哺乳动物染色体标本成为可能。 实验用品 材料：HL60细胞 试剂：10μg/ml秋水仙素溶液，0.4%KCl，卡诺（Carnoy）固定液，Giemsa染液。 器材：离心机，显微镜，水浴锅，酒精灯，离心管，烧杯，滴管，载玻片，纱布。 操作流程 用于分带标本的细胞培养：HL60细胞于CO2培养箱中培养72hr； 用于色差分析标本的细胞培养：HL60细胞于CO2培养箱中培养36hr时加入终浓度为10μg/ml BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷），避光继续培养36hr（如果全血培养在开始培养时即添加，同时加入PHA）； 终止培养前3~5hr每个培养瓶中（10ml培养液）加秋水仙素2滴； 收集细胞：转移全部培养液到离心管中，平衡后1500rpm离心8min，弃上清； 低渗：加入0.4％KCl溶液4ml，悬浮并混匀细胞，37℃下低渗20min，加入新鲜卡诺液2滴，混匀，离心（同上），弃上清； 固定：加入卡诺液4ml，混匀，室温20min，离心，弃上清； 制备细胞悬液：加入卡诺液0.5ml，悬浮细胞； 制片：滴片，火焰干燥法制片，留存备用。 人染色体Giemsa分带 技术背景 染色体显带是一项借助某些特殊的染色程序使染色体在一定部位内显现出深浅不一的带纹的细胞学技术。由于特定染色体有其特定的带纹，因此显带可作为鉴别单个染色体和染色体组的手段。 显带技术最重要的应用就是能够明确鉴别一个核型中的任何一条染色体, 乃至某一个移位片段, 同时也可用于核型进化及可能的进化机制研究。这些在临床上可用于遗传病的诊断，科研中可用于遗传标记的利用，甚至有利于整个基因组遗传信息的分析与解读。 实验原理 Giemsa分带简称为G带，是指染色体经盐溶液、胰酶或碱处理，再用Giemsa染色后所表现出来的带型，其中尤以胰酶消化法的重复性最好。 胰酶处理法主要是将染色体制片置于胰蛋白酶中进行消化处理，处理时间随片龄（染色体制片保存的日数）和处理前烤片时间的长短而定。一般片龄长或老化程度高，处理时间就有所增加，然后直接Giemsa染色进行比较观察。 实验流程 老化：人类染色体标本制备好后室温下放置一周（或者在65℃烘箱内烤片2-3hr）； 酶解：将标本玻片放在0.05%的胰蛋白酶液中处理10-30sec（分区选择适当的酶解时间）； 漂洗：蒸馏水中漂洗掉残留酶液； 染色：Giemsa染色15min，流水冲去残留染液，空气干燥； 镜检观察。 人类姐妹染色单体色差分析 技术背景 来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换（sister chromatid exchange，SCE）。SCE反映了DNA的损伤，可以使用SCE作为哺乳类动物突变形成的指标。由于SCE分析方法比观察染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现出很好的剂量－效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常规指标之一。 实验原理 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）在DNA合成过程中可以作为胸腺嘧啶T的替代品掺入到新合成的DNA链中。哺乳类细胞在含有适当浓度的BrdU的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体（姐妹染色单体）的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA的T位完全由BrdU代替，而另一条染色单体的两股 DNA中的一股含BrdU，另一股则不含BrdU。两股都含有BrdU的染色单体见光容易分解，Gimsa染色后为浅染。这种染色方式称为姐妹染色单体区分染色（sister chromatid differentiation，SCD）。如果姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段。 实验流程 老化：染色体标本避光室温下放置3~7天老化，（或37±5℃温箱内处理24hr）； 光照：将标本玻片用45℃1×SSC盐溶液润湿，紫外照射15min左右（通过实验确定最佳照射时间）； 水洗：蒸馏水洗去残留SSC溶液； 染色：Giemsa染色15min，流水冲洗，空气干燥； 镜检观察。 预期实验结果 悬浮细胞染色体标本的制备 动物染