第二章_培养基精品.pptVIP

细胞用液的分装方法和要求: * 联合使用： 常用的配制方法（0.25%trypsin-0.04%EDTA溶液）： 胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-)液100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22μm滤膜正压过滤，-20℃冰箱保存。 * 消化细胞间质，分离上皮细胞与胶原成分。 根据细胞类型选用不同型号胶原酶（Ⅰ-Ⅳ）。 新鲜配制、 37-38oC作用、时间控制。 EDTA不可与胶原酶联用，因胶原酶的消化作用依赖于钙。 附：细胞外基质成分有胶原、纤粘蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、弹性蛋白等） 胶原酶液 ： * （四）、pH 调整液： NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 * （五）、HEPES溶液： 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L（分子量238.31）溶液 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L * （六）、谷氨酰胺补充液： 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加. 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 * 使用终浓度为1-4mmol/L 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制方法为 ： 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L * （七）、酚红： 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH * 七、酚红： 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用. * （八）、抗生素溶液： 抗生素使用种类与浓度： ?????????????? 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 u/ml -20℃ G(+) streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) 、G(-)、支原体amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ 真菌(二性霉素B） nystatin 50 ug/ml -20℃ 真菌（制霉菌素） * 抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位 * 抗菌素液（青、链霉素： ）： 青、链霉素：最终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。 一般市售市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解在10ml Hanks液或三蒸水中，取8ml链霉素液溶解80万U/瓶青霉素，即成为青霉素、链霉素各1.0×105U/ml的母液.使用时每100ml培养液中加0.1ml，即成最终浓度为100U/ml。 * 三、培养基 培养基——维持体外细胞生存和生长的溶液 ● 天然培养基 取自动物 营养成分丰富；来源受限 血清： 小牛、胎牛、马、人（市售） 须灭活补体（56oC、30min）、- 20oC保存 质量差异大（无细菌、支原体、病毒） 血浆 鸡血浆；现少单独使用 合成培养基： * 合成培养基： 合成培养基 一般需加血清等 成分 氨基酸、维生素、糖类、无机离子、辅助成分 * 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点