[医学]临床生物化学实验室技术与管理.ppt

临床生物化学实验室基本技术与管理 教学目标和要求 掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数法、荧光法和比浊法测定的方法原理，在生化检验中的应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意事项。 熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析技术、生物传感技术的概念和应用原理。 了解光谱、层析等常用生化技术的应用原理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。 本 章 主 要 内 容 色谱检验技术 电泳技术 免疫学检验技术 电化学分析技术 生物传感技术 光谱检验技术 第一节 光谱检验技术 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。 根据物质对光谱响应特征的不同，可把光谱检验技术分为发射光谱分析技术、吸收光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。 在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。它既可以研究物质的结构分析，也可以对特定物质进行定性或定量的分析。 一、吸收光谱分析法 吸收光谱是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生的暗线或暗带组成的光谱。它是物质定量测定的基础。 一、吸收光谱分析法 利用吸收光谱对物质进行定量的技术就是吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一。它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛。 目前最常应用的技术有可见-紫外光光度分析和原子吸收分光光度法。 可见－紫外光分光光度法 1检测原理 可见-紫外光分光光度法的理论基础基于朗伯－比尔定律。 可见-紫外光区一般是指波长从200nm至760nm范围内的光，其中小于400nm的是紫外光。 该分析是根据物质的分子对光的吸收特性进行物质定量分析或分子结构分析的方法。 2.测定方法 在可见-紫外分光光度法中，通常在测定未知样品浓度的同时，与同一个已知浓度的标准物作比较，可以利用以下公式计算而求出其浓度,即比较法。 因为As= KCsb　Ax= KCxb 其中A为吸光度， C为溶液的浓度，其下标s、x分别表示属标准物、待测物；k为常数，b为比色杯的光径。 若将一系列浓度不同的标准液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。 4.分光光度法的建立 首先要确定显色液的最大吸收峰。 在其它条件不变的情况下，在一定范围内以一定的步长调整波长，并记录相应波长时的吸光度，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就是该反应液的吸收光谱（如图2-1 ），在吸收曲线上的峰称吸收峰，其对应的波长称最大吸收波长，即可确定该显色液的测定波长。 图2-1吸收光谱图 二、发射光谱分析法 临床生物化学检验常用的有荧光分析法和火焰光谱法。 由于火焰光谱法目前应用越来越少，在这里就不再详细描述。 荧光分析法（fluorometry） 有些物质物质受到有较高能量的光（如紫外光）照射时，在吸收了某些波长的光后，会发射出不同波长和不同强度的光，照射停止，发光亦随之消失，这种光称为荧光。 荧光分析法（fluorometry） 在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强。 对荧光物质进行定量测定的方法称为荧光分析法。 荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达10-13g/L,对特定物质甚至可达到10-15g/L。 荧光分析技术的应用 荧光物质的最大吸收波长和最强荧光波长是鉴定物质的依据。该法灵敏度高、取样量少，因此被广泛应用于各领域，在临床生物化学检验中主要用于糖类、胺类、甾族化合物、DNA与RNA、酶与辅酶、维生素等物质的分析。 第二节、电化学分析技术 电化学传感器在临床生化分析的应用中占据着主导的地位。其原理是将电极浸入待测溶液中组成原电池，其中一支电极的电极电位与待测离子的活度有关，此电极称为指示电极；另一支电极是电位已知并且恒定的所谓参比电极,目前最常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。这里主要介绍离子选择电极分析法。 离子选择电极法的原理 离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。 离子选择电极法的原理 ISE法的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。 ISE的特点 ①选择性好:多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定； ②灵敏度高：可达10-5～10-8mol/L, 线性范围宽 ③溶血、脂血及黄