[理学]02-蛋白质共价结构.pptVIP

* (一)、蛋白质测序的策略 样品：均一，纯度 97%，已知相对分子量 Sanger法测序步骤 1、测定多肽链数目 确定N-末端或C-末端残基的摩尔数 末端残基的摩尔数 蛋白质摩尔数 ＞ 1 多条肽链 ＝ 1 单体，一条肽链 末端残基不相同时，表明蛋白质由不同肽链组成 * 变性剂： 8M 尿素，6M 盐酸胍 断裂二硫桥 2、建立测序参考点 鉴定末端残基，测定每条多肽链的氨基酸组成 3、降解多肽链 得到二套以上的肽段进行组成和末端残 基分析 4、氨基酸测序（Edman法、酶解法、质谱法） 5、构建完整肽链 6、确定二硫键位置 拆分亚基 * (二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定 1、N-末端分析 1）二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB）法 Sanger反应 * (二)、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 2）丹磺酰氯（dansyl chloride， DNS）法 5-dimethylamino- naphthaline-1- sulfonyl chloride 优点：灵敏度比DNFB法高100倍 * 3）苯异硫氰酸酯（PITC）法 Edman法 特点：能依次从肽的N-端逐一切割氨基酸残基 4）氨肽酶法 亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶 特点：从肽链 N- 端逐一降解氨基酸，适用于N- 端的氨基酸残基被封闭的肽（如环肽） * (二)、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 2、C-末端分析 1）肼解法： Gln、Asn、Cys被破坏, Arg转变为鸟氨酸 * 2）还原法 还原，水解，用HPLC等方法分离鉴定 3）羧肽酶法 特点：从羧端逐一降解氨基酸 CPA：水解除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C-末端残基 CPB：只水解Arg、Lys为末端的肽链 CPY：所有氨基酸 * (三)、二硫键断裂 * (四)、氨基酸组成分析 酸水解方法：6 mol/L HCl, 110℃ 特点：氨基酸不消旋 缺点：Trp完全破坏 Ser、Thr、Tyr部分破坏 Gln、Asn的酰氨基被水解 碱水解方法：5mol/L NaOH，110℃ 特点：Trp可定量回收 缺点：大部分氨基酸被破坏 * (四)、氨基酸组成分析 AA 残基 鸡溶菌酶 牛β乳球蛋白 菠菜铁氧还蛋白 烟草花叶病毒外壳蛋白 马细胞色素c 牛核糖核酸酶 人碳酸酐酶 蚕丝心蛋白 Ala 12 15 9 14 6 12 19 45 Val 6 9 7 14 3 9 17 9 Leu 8 21 8 12 6 2 20 2 Ile 6 10 4 9 6 3 10 1 Pro 2 8 4 8 4 4 17 7 Met 2 4 0 0 2 4 2 0 Phe 3 4 2 8 4 3 11 4 Trp 6 2 1 3 1 0 6 1 Gly 12 3 6 6 12 3 16 74 Ser 10 7 7 16 0 15 30 17 Thr 7 8 8 16 10 10 14 2 Cys 8 5 5 1 2 8 1 2 Tyr 3 4 4 4 4 6 8 23 Asn 13 5 2 10 5 10 17 1 Gln 3 9 4 9 3 7 9 0 Asp 8 11 11 8 3 5 14 4 Glu 2 16 9 7 9 5 13 4 Lys 6 14 4 2 19 10 18 5 Arg 11 3 1 11 2 4 7 3 His 1 2 1 0 3 4 11 2 总数 129 160 97 158 104 124 260 206 * (五)、多肽链的部分裂解 降解 分离 1、酶切法： 优点：专一性强，断裂点明 确，反应产率高 酶：蛋白水解酶（protease） 常见蛋白酶： 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶等 在肽链内有固定的酶切位 点，也叫内