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基因工程与生物柴油 内容简介 生物柴油的出现 生物柴油 ?生物柴油（Biodiesel）是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料通过酯交换工艺制成的可替代化石柴油的再生性柴油燃料。 ?与化石柴油相比，生物柴油具 有自身的特点和优点。 如：较好的环保性、较好的安 全性、较高的燃烧性能和可再 生性等。 化学生产 ?化学法生产是采用生物油脂与甲醇或乙醇等低碳醇，并使用氢氧化钠 (占油脂重量的1%) 或甲醇钠 做为触媒，在酸性或者碱性催化剂和高温（230～250℃）下发生酯交换反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗涤干燥即得生物柴油。 ?化学合成存在一系列缺点：反应温度较高、工艺复杂；反应过程中使用过量的甲醇，后续工艺必须有相应的醇回收装置，处理过程繁复、能耗高；使用酸碱催化剂产生大量的废水等。 生物酶法合成 ?为解决上述问题，人们开始研究用生物酶法合成生物柴油，即用动物油脂与低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。 ?目前生物柴油的生产流程如下： 基因工程 基因工程与原料 弱化PEPase表达 ?PEPase催化丙酮酸生成草酰乙酸进入蛋白质代谢。降低其表达活性可以使丙酮酸进入脂肪酸代谢途径，大量合成脂肪酸。 ?陈锦清等利用反义基因技术，结合根癌农杆菌介导法将反义PEP基因导入油菜，控制PEP基因的表达量。 导入的质粒中含有人工构建的带Anti-PEP，其能够在植物体内表达反义RNA，与PEP-RNA结合抑制其表达。 超量表达acc基因 ? ACCase酶是脂肪酸合成的关键酶，催化乙酰CoA生成丙二酸单酰辅酶A。利用基因工程超量表达ACCase可以提高脂肪酸含量。 ?胡亚平等（重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建；2009)利用转录产物作为模板，通过重叠延伸PCR技术成功克隆了长约7kb的ACCase基因编码区。 由扩增基因构建载体pBIL2PTNap。 此项研究对后续将构建质粒导入产油植物中以达到超量表达ACCase酶并获得高产油品种有很大帮助。 ? Roesler 等（Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds；1997）将真核形式的ACCase 与叶绿体转运肽融合，在Napin启动子的作用下，成功将其在油菜的质体中过量表达，使ACCase活性比野生型对照提高了10～20倍，种子的含油量提高了5％。 改变油脂中脂肪酸组分 ?生物柴油的原料油脂多为饱和脂肪酸。利用基因工程手段改变产油植物的脂肪酸组分是降低生物柴油成本的一种途径。 另外，低粘度生物柴油的制备来源于短链脂肪酸。所以提高植物中中短链脂肪酸含量为其生产提供更好原料油。 ?脂肪酸合成酶FAS（Fatty acid synthase ）：催化丙二酰辅酶A继续合成脂肪酸。植物体内ACF由ACP（酰基载体蛋白）和其他6种酶构成。 ? Dehesh. K等（Overexpression of 3-Ketoacyl-Acyl-Carrier Protein Synthase IIIs in Plants Reduces the Rate of Lipid Synthesis；2001）克隆了编码菠菜酮酰-ACP合(KASⅢ)的cDNA基因，使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。结果与正常植株相比，饱和脂肪酸(16﹕0) 有所增加，不饱和脂肪酸含量下降。 ?同样Dehesh. K等（1996）在油菜（Canola）中转入萼距花（ Cuphea palustris）的硫酯酶基因ChFatB2,是转基因油菜种子种短链脂肪酸（8﹕0和10﹕0）大幅度提高。 工程微藻 ?微藻具有优于高等植物的光和效率和产油量，越来越受到人们的广泛关注。 利用基因工程技术构建高油脂工程微藻为生物柴油制备提供原料油脂是未来生物柴油发展趋势之一。 ?利用基因工程技术改变微藻中脂肪酸合成途径关键酶的表达是获得高产油脂工程微藻的主要手段之一。目前此项研究不多见。 ?侯李君等（蓝藻正反义pepcA基因导入对大肠杆菌中脂类合成的调控；2008）研究了将将pepcA正反向连接到穿梭表达载体pRL-489上BamHI位点之间，构建得带pepcA正反义基因的载体 pRL-Sen 和pRL -Anti pepcA，转化入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α宿主细胞中。 脂肪酶高产工程菌的构建 ?脂肪酶转酯化反应制备生物柴油是目前生产生物柴油的主要方法。