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液相色谱教程 (五)液相色谱方法开发 Waters 中国有限公司培训中心 评价液相色谱方法的标准 什么是液相色谱的分离度？ 影响分离度的因素K′,α,N 分离度方程∶ K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱 α 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度, 是化学因素 N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度 容量因子 k? 改变k值的方法∶ 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗 分离因子 α 定义∶ α=1 时两组分分不开 改变α的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 色谱柱的柱效 N α，k，N∶如何控制分离度? 开发方法的其它考虑因素 分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑: 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗 方法开发:第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解自己的样品 参照文献方法时的注意事项 采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…),否则不能重现文献结果 注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法 注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度…) 注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新,尽可能采用HPLC新技术 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能高纯度的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k′值改变保留值 调节α值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 反相色谱方法开发实例1 反相色谱方法开发实例1 反相色谱方法开发实例1 反相色谱方法开发实例2 色谱条件∶ 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 实例2:改变容量因子 K 实例2:改变选择性(α) 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱的影响会更大 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的安全范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间 离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。 常用缓冲液及其pH值 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 PIC A：磷酸季丁铵，适用于酸性组份 PIC B：烷基磺酸盐，适用于碱性组份 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱 离子对色谱机理 离子对色谱的应用 使用五烷基磺酸盐(PICB5) 使用六烷基磺酸盐(PICB6) 使用七烷基磺酸盐(PICB7) 样品浓度对分析的影响 离子对色谱分析水溶性维生素 用不同的离子对试剂 离子对色谱 - 水溶性维生素 对氨基苯甲酸与 PIC A试剂 对氨基苯甲酸与 PIC B7试剂 离子对色谱的优缺点 优点: 可用反相色谱分析离子 离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成 通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中性和离子型溶质 缺点: PIC 试剂的平衡较慢 推荐专用色谱柱作离子对分析 当心 PIC 试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀 当心用过的离子对试剂的化学污染 用离子对？还是离子抑制？ 什么是梯度方法 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 色谱柱需再生 定量分析的重复性较低 梯度洗脱的方式 高压梯度及低压梯度 梯度滞后:系统体积的影响 滞后体积大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如∶滞后体积为 2.0ml，流速 1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 普通HPLC的滞后体积为2~4ml 对分