第三章高效液相色谱及应用2h4.pptVIP

本讲小结 --- 要点回放 为了有效地选择、优化固定相和流动相，需要： 全面了解用于流动相的溶剂特性（极性、强度、选择性）和改性剂的作用及使用方法 广泛了解各种固定相的特点和新品信息 HPLC分离模式选择的一般原则 分离条件的优化 基本理念和依据: 分离度方程及其三要素 k′ 、α、N 由哪些因素来调节k′ 、α及N？ k′ 与流动相组成(主要是溶剂比例、pH等)、固定相的性质和用量及柱温有关。 α由流动相组成(特别是有机溶剂种类和pH值等)、固定相的性质及柱温等因素决定。 N（或H）主要由板高方程各项参数决定，与色谱柱长、填料粒径、填充均匀度、流速和温度以及柱外效应等因素有关。  3.7.1 碳水化合物 3.7.2 脂类 3.7.3 氨基酸 3.7.4 肽和蛋白质 3.7.5 维生素 3.7.6 食品添加剂 3.7.7 生物活性成分 3.7.8 生物代谢产物 3.7.9 环境分析 3.7.1 碳水化合物 单糖和寡糖的直接测定 单糖和寡糖的柱前衍生化分析 多糖的分子量分布分析 单糖和寡糖的直接测定---柱系统概述 胺基键合相与糖羟基的氢键作用 胺基柱分析低聚异麦芽糖产品 胺基柱分析银耳多糖的单糖组成 胺基柱分离8种中性单糖 配位交换 (一般与体积排阻等其他分离模式混合作用于某一柱系统中) 钙型阳离子交换柱（Sugarpak1）分析8种中性单糖 钙型阳离子交换柱（Sugarpak1）分析低聚异麦芽糖产品中不同聚合度糖组分的相对比例 单糖和寡糖的直接测定--检测器的选择 示差折光检测器 蒸发光散射检测器 脉冲安培检测器 (用于“离子色谱”分析糖) 质谱检测器(LC-MS) 紫外检测器 单糖和寡糖含量测定—样品预处理 最常用的提取剂是70~80％乙醇 :可沉淀其中的蛋白质和大分子糖 ;乙醇最好在后续处理中除去. 另外除蛋白的方法还有:三氯乙酸或高氯酸沉淀，上清液再经KOH或KH2PO4中和；等电点沉淀法 ;超滤法 ; Sevag法,即用1/5体积的氯仿-正丁醇(4:1)加至样品中振摇,使蛋白质形成凝胶,用离心法除去。 含脂肪高的样品需脱脂 :用石油醚或乙醚、正己烷、氯仿等 有机溶剂萃取除脂,或用C18固相萃取柱吸附去脂. 样品中的有机酸和无机盐会干扰分析，且影响柱寿命，可用阴离子/阳离子混合树脂（如Amberlite MB3）去除之(离线或在线)。 单糖和寡糖分析实例(1)测定奶酪中β-半乳糖苷酶活力色谱图 色谱条件:色谱柱:钙型阳离子交换柱Aminex HPX-87C,7.6mmid×300mm;洗脱液:重蒸水;流速0.6ml/min;柱温85℃;检测:示差折光 样品处理：称取一定量的奶酪样品用0.1mol/L 的磷酸二氢钾缓冲液（pH7）稀释10倍，并加入2%（W/V）的乳糖和5mmol/L 二硫赤醇，在55℃条件下保温过夜（17h），过滤后直接进样分析，用未经缓冲液保温等处理的奶酪原样作空白对照。根据奶酪中乳糖被酶解成的葡萄糖和半乳糖的定量测定计算奶酪中微生物酶（β-半乳糖苷酶）的活力。 (2)甜葡萄酒中糖和有机酸的同时分析 样品制备 首先用离子交换固相萃取小柱将酒样中的中性和酸性化合物分离,然后用同一色谱柱和洗脱条件分别分离分析糖和有机酸. 色谱条件 色谱柱:氢型阳离子交换柱HPX-87H;流动相:0.01mol/L硫酸水溶液;柱温:65℃;流速:0.6ml/min;检测:示差析光和紫外检测器串联同时监测. 本方法在国外已被用于酒中糖和有机酸的定量测定标准方法及酒的伪劣商品的鉴定. 甜葡萄酒中糖的色谱分离图 甜葡萄酒中有机酸的HPLC分离图 (3)啤酒中单糖及低聚糖的测定 色谱条件: 色谱柱:聚合物基质氨基柱,4.6mmid×250mm,柱温：40℃；梯度洗脱程序：0-5min，70%乙腈；5-25min，乙腈70%-50%;25—30min,50%乙腈.蒸发光散射检测器(ELSD)参数:漂移管温度,90℃;氮气压力,1.5Bar. 样品处理: 取一定量啤酒样,轻轻振摇或微热以去除CO2 ,取其脱气后的酒样0.5ml上C18固相萃取小柱,用水洗脱并定容到10mL. 48种芬兰啤酒和48种其他国家的啤酒中碳水化合物的含量. (4)聚合物基质C18柱分析淀粉水解液(示差折光检测器) (5)环糊精键合相分离寡糖 柱前衍生法分析单糖和寡糖PMP紫外标记柱前衍生法分析多糖的单糖组成(8种中性糖、2种糖醛酸及2种糖胺) 流动相的乙腈体积比对10种单糖-PMP衍生物的保留及分离的影响 流动相的pH对10种单糖-PMP衍生物的保留及分离的影响 反应时间对衍生产率的影响 水解条件对盐藻多糖级分PD4a单糖组成