第一章细胞形态结构的观察方法1.ppt

五、激光扫描共聚焦显微镜 共聚焦系统? 细胞CT 激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope；LSM）是 以激光作为激发光源，采用光源 针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描， 以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。 1、荧光和荧光显微镜 荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长) 488nm 520nm 异硫氰酸荧光素(FITC) 2、荧光显微镜 激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490 紫外 蓝 绿 高压汞灯 被荧光探针染色的生物样本 激发 被标记结构的荧光光学图像 光学 成像 滤镜 分光 488nm 520nm FITC 450nm 490nm 3、普通荧光显微镜的不足 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像 与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的 紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/NA ）。但当所观察 的光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量， 而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来 自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低 （即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学 标本是层次区别的重叠结构）。 （二）激光扫描共焦显微镜的原理 *   细胞生物学实验技术 形成可验证的假说 收集整理实验结果 确定研究目标 设计实验方案 得出结论 文献检索 对实验结果进行 分析讨论 进行实验研究 细胞形态结构的观察技术 细胞组分的分析技术 细胞培养技术 细胞工程与显微操作技术 细胞形态结构的观察技术 光学显微镜技术（ light microscopy ） 电子显微镜技术（ Electro microscopy ） 扫描遂道显微镜技术（ scanning tunneling microscope ） 细胞组分的分析技术 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示技术 特异蛋白抗原的定位与定性技术 细胞内特异核酸的定位与定性技术 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术 细胞培养技术 原代组织块培养技术 原代细胞培养技术 组培技术（植物） 传代培养技术 无菌操作技术 细胞工程与显微操作技术 核移植技术 细胞融合技术 细胞转染技术 染色体工程技术 显微操作技术 细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。 光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。细胞培养技术可使细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程和显微操作技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。 第一章 显微镜技术 一、普通光学显微镜 1. 普通生物显微镜由3部分构成： ①照明系统：包括光源和聚光器。 ②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。 ③机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台) 、调节器和物镜转换器(旋转器)等。 光学显微镜的放大原理和光路图（引自汪德耀） O1 物镜； O2 目镜； O3 眼球； F1 物镜的前焦点； F2 目镜的前焦点 2. 光学显微镜的工作原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长； N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2； n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 物镜的镜口角 O 物镜； S 标本； α 镜口角 几种介质的折射率 1.00 1.33 1.46 1.51 1.52 折 射 率 空 气 水 石 蜡 油 香 柏 油 玻 璃 介质名称 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin α /2的最大值