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胶回收攻略 一、 这个回收小片断,我还比较在行,我以前的片断只有100bp 市售的试剂盒常常有小片断回收效率很低的问题。 PCR产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。进入连接反应的PCR片断量太小常常是试验失败的原因。 我的做法是，简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的PCR产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。我的做法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以试试。 大致的做法是：制作100微升PCR产物；酒精沉淀回收PCR产物；PCR产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的PCR产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1微升连接酶和1微升连接buffer，4度过夜；转化涂板。 具体的操作： PCR产物回收 1. 制备100μL PCR产物。 2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。 4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。 5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。） 酶切 直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系： PCR产物酶切－制作插入片断 10×Buffer 6μL Sal I 5μL PCR产物 —— 双蒸水 49μL 合计 60μL 要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒（小提的质粒即可）3μL进行酶切。 A质粒酶切－制作载体片断 10×Buffer 3μL Sal I 1μL 质粒 3μL 双蒸水 23μL 合计 30μL 混匀。37℃，酶切3小时。 1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法） 1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。 2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。） 3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。 4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。 5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶。胶碎裂不够细密可再次冰冻后碎胶。） 6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。 7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。 8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风） 连接 向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。） 目前我用的最好的是TAKARA的D301试剂盒我后面把说明书发来. CLONTECH的NucleoTrap Gel Extraction Kit 用3M 的NaCl或NaAc将回收胶浸泡过夜，然后用乙醇沉淀，就可以了。 0mega 我刚做了100bp的回收，回收率能达到40％。以下几点建议： 1 尽量用新配制的