基因组DNA文库Genomiclibrary构建.PDF

基因组DNA文库(Genomic library)构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别 与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇 集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上 每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段 的总汇，称为基因组DNA文库。 基因组DNA文库是由一种生物的所有基因组 DNA构建而成的。 构建基因组文库最常用构建基因组文库最常用:: •λ噬菌体载体（克隆能力约15—20 kb） ••限制性内切酶部分消化法限制性内切酶部分消化法。 基因组DNA文库的容量 可用可用ClarkClark和和CarbonCarbon公式预测公式预测一个完整基因组文库应包个完整基因组文库应包 含的克隆数目： NN=lln(1(1-p)) // lln(1(1-f)f) •N表示一个基因组文库克隆总数 •p 表示所期望的靶基因在文库中出现的概率表示所期望的靶基因在文库中出现的概率 •f表示重组克隆平均插入长度与基因组DNA总长之比。 以人为例，其基因组大小为3 ×109 bp，若要求p = 99%， 5 平均插入片段大小为20 kb，则N = 6.9 ×10 。 建立基因组文库建立基因组文库，取决于两项技术系统取决于两项技术系统 • 具有包装能力的载体系统： λ噬菌体和粘粒等 • 离体包装系统: AA ．．对带有外源对带有外源DNADNA 的杂合分子有直接筛选和的杂合分子有直接筛选和 富集的作用。 BB ．提高重组提高重组DNADNA分子产生克隆的频率分子产生克隆的频率 构建基因组文库使用的载体 •λ噬菌体：可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) •粘粒粘粒：可承载可承载45kb DNA左右片段左右片段(有效的范围为有效的范围为40 kb) •质粒质粒：：可承载可承载1515kbkb DNADNA左右片段左右片段 ((有效的范围为有效的范围为1010kb)kb) •人工染色体（酵母等，构建高等真核生物基因文库 设计） 构建基因组文库的程序 1．载体DNA片段的制备 DNADNA分离纯化分离纯化 限制酶切限制酶切 脱磷酸化反应脱磷酸化反应 2 ． 供体DNA片段的制备 总总DNADNA分离纯化分离纯化 机械剪切法机械剪切法 分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段 完全酶切完全酶切 3. 供体与载体DNA连接 44. 重组重组DNADNA分子的转化分子的转化或侵染宿主细胞或侵染宿主细胞 5.重组克隆的挑选和保存 用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA 并并利用噬 菌菌体载载体构建基因组文库库 用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一 对同尾酶消化对同尾酶消化DNADNA ，由由SauSau33AA 酶切产生的酶切产生的DNADNA 片段可插入到片段可插入到 经BamHI消化的λ噬菌体载体上。 基因组基因组DNADNA 文库的质量标准文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： • 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 •• 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆以利克隆 排序 • 克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下 • 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 此外此外，还有很多大容量克隆载体还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒如柯斯质粒、细菌细菌 人工染色体（BAC ）、P1源人工染色体（PAC ）、 酵母人酵母人工染色体染色体 （YAC ）等都等都可用用于基因组文库的构基因组文库的构 建。 它们的优点是可以插入更大片段它们的优点是可以插入更大片段DNADNA ，，但是稳定性但是稳定性 一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。 操作也相对较困难操作也相对较困难。