土壤镰孢菌RealTimeQPCR定量方法的建立及应用-大豆科学.PDFVIP

第２９卷　第４期 大 豆 科 学 Ｖｏｌ．２９　Ｎｏ．４ ２０１０年　 　８月 ＳＯＹＢＥＡＮＳＣＩＥＮＣＥ Ａｕｇ．　　２０１０ 土壤镰孢菌ＲｅａｌＴｉｍｅＱＰＣＲ定量方法的建立及应用 １，２，３ １ １，３ １ １ ２ ４ 魏　巍 ，许艳丽 ，刘金波 ，李春杰 ，韩晓增 ，李文滨 ，李淑娴 （１．中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 １５００８１；２．大豆生物学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 １５００３０；３．中国科学院 研究生院，北京 １０００４９；４．ＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈＵｎｉｔ（ＣＧＲＵ），ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ（ＵＳＤＡ ＡＲＳ），Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ３８７７６，ＵＳＡ） 摘　要：基于镰孢菌 ＩＴＳ序列，设计一对应用于实时荧光定量 ＰＣＲ（ＲｅａｌＴｉｍｅＱＰＣＲ）反应的镰孢菌属特异性引物 ＴＳ和ＴＲ，并建立了相应的ＲｅａｌＴｉｍｅＱＰＣＲ体系。应用该反应体系，绝对定量了无肥（ＮＦ）、化肥（ＮＰ）以及化肥配 施有机肥（ＮＰＭ）等 ３种施肥措施下大豆田土壤镰孢菌 ＤＮＡ含量。结果表明：引物 ＴＳ和 ＴＲ对镰孢菌属真菌有较 好的特异性；ＲｅａｌＴｉｍｅＱＰＣＲ反应的扩增曲线中各梯度浓度标准品的循环阈值（Ｃｔ值）间隔均匀，熔点曲线无杂 ２ 峰，标准曲线的相关系数 Ｒ ＝０．９９３，斜率为０．２９２７；在大豆生育时期的苗期，ＮＦ、ＮＰ及 ＮＰＭ措施下土壤镰孢菌总 ＤＮＡ每克干土中含量分别为 １８．３３、４４．６１和 １４０．８３ｐｇ，且 ＮＰＭ措施含量极显著高于 ＮＦ及 ＮＰ措施（Ｐ＜０．０１）。 关键词：镰孢菌；实时荧光定量 ＰＣＲ；绝对定量 中图分类号：Ｓ１５４．３　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１０００９８４１（２０１０）０４０６５５０４ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａＲｅａｌＴｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃ ｔｉｏｎｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．ｉｎＳｏｉｌ １，２，３ １ １，３ １ １ ２ ４ ＷＥＩＷｅｉ ，ＸＵＹａｎｌｉ，ＬＩＵＪｉｎｂｏ ，ＬＩＣｈｕｎｊｉｅ，ＨＡＮＸｉａｏｚｅｎｇ，ＬＩＷｅｎｂｉｎ，ＬＩＳｈｕｘｉａｎ （１．ＮｏｒｔｈｅａｓｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｏｇｒａｐｈｙａｎｄＡｇｒｏｅｃｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＳ），Ｈａｒｂｉｎ１５００８１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ；２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｏｙ ｂｅａｎＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ；３．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌ，ＣＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４９，Ｃｈｉｎａ；４．ＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈＵｎｉｔ （ＣＧＲＵ），ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ（ＵＳＤＡＡＲＳ），Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ３８７７６，ＵＳＡ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｏｎｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓ（ＩＴＳ）ｏｆＦｕｓａｒｉｕｍ，ａｐａｉｒｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｐｒｉｍｅｒｓ，ＴＳａｎｄＴＲ，ｗｅｒｅｄｅ ｓｉｇｎｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｏｒＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ＲｅａｌＴｉｍｅＱＰＣＲ）ｓｙｓｔｅｍｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．ａｎｄｔｈｅｎｉｔｓｏｐｔｉｍａｌｒｅ ａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｍａｓｓｅｓｏｆｇ