第20章 毛细管电泳.pptVIP

毛细管电泳法Capillary Electrophoresis 二、经典电泳分析 三、高效毛细管电泳分析 1、毛细管区带电泳 CZE 2、毛细管凝胶电泳 CGE 3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） 1.高压电源 3.缓冲液池 1、离子分析 2、药物分析 3、氨基酸分析 4、蛋白质分析 5、核酸分析及DNA排序 例：毛细管电泳（抑肽酶） sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图 还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量 乌司他丁溶液 鉴别（琼脂糖电泳） 肝素钠乳膏 还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量 乌司他丁 2010版药典二部采用电泳法的品种 2010版药典二部采用CE的品种 有关物质 注射用抑肽酶 有关物质 抑肽酶 有关物质 注射用盐酸头孢吡肟 有关物质 盐酸头孢吡肟 * * * * 一、电泳的含义 电泳：在电场作用下，电解质溶液中的带电质点在电场力作用下向电荷相反的电极方向迁移的过程。 由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。 1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典) 第一次用自由溶液电泳从人血清提取的蛋白混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，获诺贝尔化学奖。 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类： U型管电泳、柱状电泳、板电泳 按载体分类： 滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳 缺点：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 技术上的重要改进： 采用了0.05mm内径的毛细管 采用了高达数千伏的电压 特点： A、分离效率高：?104理论塔板数，接近GC 空心管，无固定液，H = B/u；流型不同 B、 分离速度快：优于LC，接近GC C、进样量少：nL 电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动 正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 负溶质离子所受的力：电场力 ? 电渗力 中性分子所受的力：电渗力 四、分离过程 电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。 流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子 电泳过程中不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。 　毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE） 　胶束电动毛细管色谱（MECC） 　毛细管离子分析 五、主要分离模式 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 最基本、应用广的分离模式 正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 负溶质离子所受的力：电场力 ? 电渗力 中性分子所受的力：电渗力 流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶,类似分子筛的作用 ——试样分子按大小分离。 蛋白质、DNA等的 m/z与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。 （1）缓冲液中加入表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束(假固定相)。 （2）电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流ν电泳 ，电场力的作用下负电胶束以较慢的速度向负极移动； （5）色谱与电泳分离模式的结合。 （3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； （4）可用来分离中性物质。 3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） 4、 毛细管电色谱 CEC 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程 固定相：依HPLC理论和经验选择，反相应用多 缓冲液：水溶液或有机溶液。 常用甲醇-水、乙睛-水等 六、　高效毛细管电泳仪器 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源 （2）电场强度程序控制系统 （3）电源极性易转换 要求：电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性 材料：石英（各项性能好）、玻璃 规格：内径20~75 um，外径350~400um；长度=1m 2. 毛细管柱 要求 化学惰性 机械稳定性好 ——玻璃瓶 4. 检测器 类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-13～10-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-15～10-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-18～10-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导