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实验三 磷钨酸-镁沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C） 生物化学与分子生物学实验教学中心 血浆脂蛋白分类 乳糜微粒（CM） 极低密度脂蛋白（VLDL） 低密度脂蛋白（LDL ） 高密度脂蛋白（HDL） 血清脂蛋白的测定原理 在脂蛋白中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，较难定量。由于其中的胆固醇含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）。 HDL的作用 血管内的“脂质清道夫” 抗动脉硬化因子 长寿因子 好胆固醇 冠心病的保护因子 实验目的 掌握磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C基本原理。 熟悉磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C手工法操作过程。 了解磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C对判断高脂血症、预防动脉粥样硬化和冠心病的重要临床意义。 实验原理 实验原理 试剂 1.沉淀剂 磷钨酸 100mmol/L 氯化镁 5mmol/L 2.酶试剂（试剂R） GOOD＇S缓冲液（pH6.7） 50mmol/L 苯酚 5mmol/L 4-氨基安替比林 0.3mmol/L 胆固醇酯酶 200U/L 胆固醇氧化酶 100U/L 过氧化物酶 3KU/L 3.胆固醇标准液（1.22mmol/L） 器材 1.分光光度计 2.离心机 3.水浴锅 4.试管、离心管、试管架 5.加样枪 操作步骤 操作步骤 数据处理 计算 参考范围 血清HDL-C：0.9～2.0mmol/L 注意事项 1.血清在室温条件下，各类型脂蛋白之间还会发生脂质交换，游离的胆固醇也会不断酯化，所以要及时测定，否则应该冰冻保存，但是只能冰冻一次，解冻后应立即测定。 2.离心过程中应该防止温度升高使沉淀不完全，室温应为15～25℃之间，且离心后立即吸取上清液进行测定，否则结果偏高。 3.血清严重混浊时，可以将血清以生理盐水1：1稀释后再沉淀，测定值乘以稀释倍数即为实际值。 临床意义 HDL是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，是冠心病的保护因素，冠心病的发病率与血清HDL水平呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病的危险因素，其增高被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化等。 高TC（总胆固醇）血症常伴有低HDL-C;肥胖者、吸烟者的HDL-C也常偏低，但饮酒和长期体力活动会使之升高。 复习思考题 1. 临床实验室测定HDL-C的方法有哪些？ 2. 温度是如何影响磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C？ 3. 简述检测HDL-C的临床意义。 生物化学与分子生物学实验教学中心 * CM VLDL LDL HDL 转运外源性脂肪 转运内源性脂肪 将肝合成的内源性胆固醇运到肝外。 将肝外衰老细胞膜中的胆固醇运到肝内降解排出体外。 脂蛋白 功 能 apoB100 45-50% 胆固醇酯:40-42% 含胆固醇及其酯最多，40~50% 1.006~1.063 LDL 20% 胆固醇酯:15-17% 15% 胆固醇酯:10-12% 1-4% 胆固醇酯:3% 胆固醇 脂类 apo AⅠ、 AⅡ apoB100、CⅠ、CⅡ CⅢ、 E apoB48、E AⅠ、AⅡ AⅣ、CⅠ CⅡ、CⅢ 载脂蛋白组成 含脂类50% 含TG 50~70% 含TG最多， 80~90% 组 成 1.063~1.210 0.95~1.006 ＜0.95 密度 HDL VLDL CM 血浆脂蛋白的组成特点 HDL 血清中 LDL VLDL CM 沉淀剂 HDL（上清液）+ LDL VLDL CM ApoB + 多阴离子化合物 沉淀↓ 多阴离子化合物：  硫酸葡聚糖--Mg2+ 肝素--Mn2+ 磷钨酸--Mg2+ 2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚 POD 红色的醌亚胺化合物 胆固醇酯 + H2O 胆固醇酯酶 游离胆固醇 + 游离脂肪酸 胆固醇 + O2 胆固醇氧化酶 4-胆甾烯酮 + H2O2 反应生成的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中的HDL-C含量成正比。 1.HDL-C分离 血