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细胞转染暨 活细胞工作站技术 张海燕 转染技术 主要内容 概述 常规转染方法 转染技术的分类 稳定细胞系的构建 注意事项及影响因素 RNA干扰技术 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技 术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。 术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。 核膜 细胞膜（壁） 细胞转染方法 物理介导：电穿孔法 显微注射 基因枪 化学介导：磷酸钙共沉淀法 DEAE-葡聚糖法 脂质体转染方法 生物介导：原生质体转染 病毒介导的转染 物理介导--电穿孔法 电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。 电穿孔法的特点 优点：转染效率较高 缺点： 需要昂贵的仪器 （电穿孔仪）。 对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞 和DNA。 每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。 电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常 重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会 不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。 物理介导法--显微注射 在显微镜下操作的微量注射技术。 可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器) 或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核 酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射 到细胞质或细胞核内。 显微注射的特点 优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬 时转染。 缺点：在导入DNA 时需要一个细胞一个细胞 地注射，不适合大量转染细胞研究的需要。 适用于制备转基因动物 物理介导法--基因枪 一种将遗传物质或其他物质附着于高速微弹 直接射入细胞、组织和细胞器的转染方法 。 可以将大分子导入细胞。 便携式基因枪 高压气体基因枪 化学介导法--磷酸钙共沉淀法 磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞 表面的结合。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一 定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合 物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进 入细胞质。 沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关 重要。 磷酸钙共沉淀法的特点 优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转 染都可以。 缺点： 转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞 核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中 进行稳定表达。 重复性不佳： pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、 细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产 生影响。 在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为 甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 化学介导--DEAE-葡聚糖法 相对简单，重复性比磷酸钙好。 不适用于稳定转染，转染时要除掉血清。 一般只用于BSC-1 （猴肾细胞）,CV-1,COS细胞系。 化学介导--脂质体转染 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将 DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋 在脂质