细胞工程学-第5章.pptVIP

大微囊： 细胞生长慢且分泌产物少。当PLL/ALG微囊的直径超过500μm时，细胞的增殖便受到明显的抑制。 综合因素： 微囊大，容易制备；微囊小，制备困难。微囊的直径控制在200～400μm较为适宜。 固体基质微载体培养动物细胞存在 两个缺点： （1）大多数通用的微载体基质能牢固的吸附培养基中的血清，致使微载体变性，很难处理使其恢复，故只能一次性使用，因而产品的成本高。 （2）需要胰蛋白酶消化细胞/微载体，这一过程往往有大量的细胞损失掉，有时能高达20%。 Charies等人研制开发了液膜微载体新工艺，将氟碳化合物液体与接种细胞培养基在乳化状态下搅拌混合，氟碳化合物即分散形成100-500μm微液珠，动物细胞即贴附于微液珠表面生长和扩展。 当停止搅拌时，将混合物离心分相，培养的细胞游离地悬浮在轻相（有机相）和重相（培养基相）之间，有明晰的界面，用移液管即可方便地移出。这一工艺革除了胰蛋白酶消化程序，氟碳化合物经洗涤处理后又可重复使用。 五、研发国产微载体的必要性 我国微载体系统大规模动物细胞培养起步较晚，微载体市场又为国外商品所垄断。 研制开发国产微载体并实现系列化，满足国内对病毒疫苗等高疗效药物和诊断试剂的迫切需要是非常必要的。 微载体是一种价格昂贵的细胞培养专用介质，其销售价仍呈上涨趋势。 大部分微载体只能使用一次，而国产微载体价格则大大低于同类进口产品，实现微载体国产化，可节省大量外汇，降低产品生产成本，具有十分明显的社会效益和经济效益。 第 六 节 动物细胞的微囊化培养技术 动物细胞的大规模培养存在困难： 动物细胞生长速率慢，产物生产率低，造成产物浓度低； 培养基成份复杂，价格昂贵； 动物细胞没有细胞壁，易受机械搅拌所引起的剪切力的影响和损伤； 常规细胞培养方法不适用于大规模培养。 大规模动物细胞培养所需费用高，技术难度大。 一、动物细胞的微囊化 （一）微囊化概述 微囊化是固定化技术中的一种，它是用一层亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，从而使得酶等生物大分子和细胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜，达到催化或培养的目的。 微囊化细胞的模式图 发展历史： T.M.S.Chang在60年代后期首先提出了人工细胞的概念。他将酶、辅酶、激素、蛋白质、离子交换剂和活性炭包在微囊里，从而达到反复催化化学反应的目的。 70年代末至80年代初，Lim和Sum应用海藻酸--聚氨基酸制备微囊化细胞获得了成功，细胞在微囊里能够成活，亦能培养生长。 优点： 降低剪切力，形成小环境。 动物细胞微囊化后，与游离细胞比较，降低了培养时对细胞的剪切力，微囊里实际上是一种微小的培养环境，与液体培养差不多，能使细胞生长良好。 提高细胞密度、增加产物浓度和纯度。培养过程中，微囊化能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。 动物细胞微囊化克服了大规模细胞培养的一些缺点。 （二）动物细胞微囊化方法 包埋生物大分子及细胞必备条件： 1.不伤细胞。微囊化的过程温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备； 2.无毒。微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用； 3.保证物质交流。微囊化所形成的膜必须能使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制； 4.足够强度。膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至使微囊破裂。 目前的方法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）法。 聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化 原理： 海藻酸是以1，4键连接的聚醛酸，其主要成份是甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。当它的水溶液以钙盐的形式存在时，则成凝胶状态；而用螯合剂将钙离子去除后，则海藻酸又回复到溶液状态；当海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部分不再被螯合剂去钙而溶解。 微囊化装置及步骤 ： 微囊发生器 为得到一定大小、非常均一的微囊，制备微囊需要微囊发生器来完成。 制备微囊化动物的步骤： 无菌收集动物细胞，离心后用生理盐水洗涤 离心收集细胞，加海藻酸钠溶液混合均匀，成悬浮液； 将悬浮液装入微囊发生器，制成微滴 凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中， 使之形成膜； 微滴加到CaCl2溶液中形成凝胶珠 凝胶珠用生理盐水洗去残留的CaCl2 生理盐水洗涤 得到动物细胞微囊 凝胶珠加0.05mol/L柠檬酸溶液处理 使半透膜的ALG成液态 生理盐水洗涤 悬浮于培养基中培养 （3）影响微囊化的一些因素 关键：选择微囊半透膜的孔径。 选择微囊半透膜的孔径是培养基营养成分、代谢物进行膜内外交换、截留一定