[教育]制药第1、2章.ppt

有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成 平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。 2.2 平头末端连接 T4DNA连接酶 连接效率低（1%） 不利于重组分子环化 （1）同聚物加尾技术 末端转移酶（Terminal transferase）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3羟基端。 （2）衔接物连接技术 衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 双衔接物连接法的基本程序 cDNA链的合成 通过DNA聚合酶合成第二链 加入Sal I衔接物 S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I （3）DNA接头连接法 DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 当DNA接头的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。 DNA接头连接法 三、将人工重组DNA分子导入宿主细胞 （一）宿主细胞的选择 宿主大肠杆菌的条件 高效吸收外源DNA 外源DNA能够高效复制 具有重组缺陷 不具有限制修复系统 安全性 （二）将重组DNA导入宿主细胞 1.感受态细胞 感受态：宿主细胞能够吸收外源重组DNA分子 的生理状态。 2.将外源重组DNA分子导入宿主细胞的转化反应 （1）热休克 （2）电转化 四、重组分子的鉴定和筛选 （一）重组体表型特征的鉴定 （1）抗菌素平板法 （2）插入失活法 （3）插入表达法 （4）蓝白斑筛选 lacZ的显色原理 X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。 是β-半乳糖苷酶的显色底物,在β-半乳糖苷 酶的催化下会产生蓝色产物。 ?IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 异丙基-β-D硫代半乳糖苷, 能对乳糖操纵子产 生极强的诱导效应。 在IPTG的诱导下，pUC载体合成β-半乳糖苷酶 的α链，宿主产生β-半乳糖苷酶β链，将X-gal 分解成蓝色物质，结果大肠杆菌为蓝色菌落。 外源基因插入pUC载体，使之不能产生β-半乳糖 苷酶的α链，结果大肠杆菌为白色菌落。 （二）重组DNA分子结构特征的鉴定 （1）酶切法筛选 （3）菌落（噬菌斑）原位杂交 （4）Southern印迹杂交法 （2）PCR鉴定 （5）DNA序列测序 1977年，Sanger在加减法基础上创造了双脱氧核苷酸末端终止法。 原理：利用大肠杆菌DNA聚合酶I，以单链DNA为模板合成互补的DNA链。大肠杆菌DNA聚合酶I的合成需要寡聚核苷酸引物，根据碱基配对的原则，将脱氧核糖核苷酸(dNTP)底物加到引物的3’-0H末端使引物延伸，链的延长通过引物的3’-0H基与脱氧核糖核苷酸底物的5’-磷酸基团生成磷酸二酯键而实现，其方向由5’到3’。 DNA序列测序----末端终止法 Sanger发现在DNA聚合反应过程中，接入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)底物时，它的5’-磷酸基团是正常的，能够加到正常核苷酸的3’-OH基末端。但其自身3’-OH基团由于脱氧而不存在，下一个核苷酸不能通过5’-磷酸与之形成磷酸二酯键，使DNA链的延伸被终止于这个异常的核苷酸处。因而在4种反应体系中分别加入4种不同的5’，3’-双脱氧核苷酸底物，就可以得到终止于特定碱基的一系列寡聚核苷酸产物。 1) 待测DNA制备：通常将待测DNA片段克隆到 噬菌体M13或质粒DNA中。克隆在M13中可 以制备出纯的单链DNA作模板。在质粒中 做为双链测序的模板。 2) 人工合成的寡聚核苷酸与模板退火： 对克隆到噬菌体M13或质粒载体中的DNA进行 序列测定，可以利用与载体多克隆位点一侧 的载体序列互补的寡聚核苷酸(一般15-30bP) 作为“通用引物”。 3) 合成： 延伸反应退火后的模板引物分置4个反应管中： 4种脱氧核糖核苷酸① 其中一种(通常为dAl7)为放射性核素标记 ② 一种2’,3’-双脱氧核糖核苷酸 将ddNTP的浓度调整到适当的大小，使得DNA聚合酶催化的引物延伸反应，能够终止于所有不同位置的特定碱基的3’末端，并带有放射性核素标记。引物延伸反应终止后得到同位素标记的单链DNA分子，经加热变性和测序凝胶电泳分离，再从放射自显影得到的图谱直接读出DNA序列。 第六节 已投入市场的基因工程药物 一、治