第7章_种质离体保存教材教学课件.pptVIP

第七章　种质离体保存;几个相关概念（见《园艺植物育种学》）;种质资源保存方法;第一节 概 述;二、超低温保存的概念; 但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如 果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭 受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5℃，枳壳 通常在-20℃左右（沈德绪等，1986）。;低温保存（Cryopreservation），是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在低于-80℃条件下保存的方法。 超低温保存：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在-196℃的极端低温下保存的方法。;超低温保存的优点:;超低温保存的意义:; 常用的超低温保存方法： 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法;1.细胞内外水分的冻结特性;根据Luyet的冻结理论（1937），细胞内游离水的冻结温度（-30℃）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法一般以-30℃为基础的。 也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技术的关键。;超低温保存的原理;根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：;2.低温下细胞的致死损伤;第三节 超低温保存的方法;一、传统的降温冰冻方法 1．慢冻法：以0.5-2℃/min速度降温至-100℃后投入液氮，或以该速度一直降温至-196℃后投入液氮。 在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰 晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”。因此，对于原生质 体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。;2．快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对含水量高的细胞培养物则不适合。;3．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的速度(0.5 ～ 4℃/min)降至-30～-40 ℃，停留0.5～1h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一性冰晶。;4. 干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。;二、玻璃化保存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。;1.玻璃化法 玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液快速脱水 后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃 态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发 生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当保 存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料能 够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。;2.包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。 先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻 璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高， 可能是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液的毒性。;包埋玻璃化的实例;第四节 影响超低温保存效果的因素;一、材料的基本特性;二、预处理和低温锻炼;三、冰冻保护剂的应用;渗透型冰冻保护剂;非渗透型冰冻保护剂;四、解冻方法;　另外，不同材料或方法采用的化冻方式也有不同： 材料含水量：液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。 材料的生理状态：生长季节中的材料，一般在37～45℃温水浴中快速化冻（500-700℃/min）比在室温下慢速化冻要好，而木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。 保存方法：玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。;1. 冷冻保存后细胞和器官活力的检测;　　经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心维护： 培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周，再转入正常光照下培养。 培养基:一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以利于材料的恢复生长。 ;六、超低温保存中变异及其检测; 为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如RFLP和RAPD）等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。;种质超低温保存