同源重组的细胞与分子机制1.pptx

同源重组的细胞与分子机制;文献分析;DNA剪切的模型及具体过程；;Model for the reconstituted DNA motor-driven end resection pathway;①MRX与断裂处3单链结合； ②STR在MRX的作用聚集在末端； ③Sgs1从3端向5端运动，解旋DNA； ④Dna2从5端向3端运动，逐渐剪切5端单链DNA； ⑤RPA在另一侧暴露的3单链上结合。;DNA剪切的模型及具体过程；;各个复合物及其功能;对不同酶的作用分析;DNA剪切的模型及具体过程；;Reconstitution and 5 polarity of DNA end resection.;对5端的剪切特异性分析;其它验证剪切具有特异性的实验内容;对5端产物的分析;DNA剪切的模型及具体过程；;DNA解旋对ATP的依赖性;Dna2和Sgs1解旋酶对DNA剪切的必要性;Dna2蛋白具有剪切3或5核酸内切酶的活性，而Mre-11蛋白具有从3到5核酸内切酶以及DNA结构特异性内切酶的活性。;Sae2蛋白与初始剪切相关联，但它的添加不影响剪切的效率或产品尺寸;参与剪切的蛋白质分子特异性;DNA剪切的模型及具体过程；;MRX和Top3–Rmi1的促进作用;1. 通过His6标签（Nickel）或FLAG标签（a-FLAG） 下拉与FLAG-His6标记的Dna2或Sgs1，以测试它 们与MRX（a）或Top3-Rmi1复合物（b）的 结合程度。 2. MRX与Sgs1结合较强，也与Dna2结合。 3. 因为MRX会与DNA末端结合，所以它可能与 Sgs1和Dna2在DNA末端的聚集有关。这个理论 得到了实验的支持，因为已经预处理生成3- ssDNA末端的DNA可以被Sgs1–Dna2–RPA体系 高效地剪切，不论有无MRX。 4. Top3-Rmi1也与Sgs1结合，同时与Dna2之间有 较弱的相互作用。 ;1. Top3-Rmi1和Sgs1共同作用可以 抑制有丝分裂交叉形成，这可能 是通过降解霍利迪连接体来实现。 2. 催化无效的top3-Y356F突变体不 影响剪切的效率。 与野生型 Top3对比可以证明top3-Y356F 突变体在剪切上没有缺陷。 ;3. 体外体系中，Sgs1，Rmi1和Top3均存在时 可以分解霍利迪连接体，但top3-Y356F突变 体无法则无法做到。 4. top3-Y356F等位基因不能抑制top3Δ细胞中 较高水平的有丝分裂交叉。 5. 结论：Top3的催化活性对于控制交叉互换是 必要的，但对于DSB剪切是不必要的。;DNA剪切的模型及具体过程；;RPA的作用;4. 为了验证yRPA在剪切中的特异性，我们使用了 带有标记的3-或5- ssDNA末端的部分双链 DNA底物来检查yRPA，hRPA和SSB如何影响 Dna2的核酸酶活性。 5. 结果发现，yRPA通过Dna2增强了对5-DNA剪 切，同时抑制了对3-DNA剪切。 6. 重要的是，hRPA和SSB对Dna2核酸酶功能确实具有很强的抑制作用。;7. 部分缺陷的dna2-Δ405N突变蛋白与RPA的相互作用 较弱，受到yRPA的促进作用较弱，因此剪切效果明 显低于正常的Dna2。 总结：RPA促进了Dna2对5端的特异性剪切， 同时通过与3端单链相结合保护了3端。;结论与展望;DNA的解旋依赖于Sgs1蛋白;8;其它补充内容;;MRXs different function in free end and blocked end;;MRX-Sae2复合物（MRXS）介导短程切除。 在敲除RAD50或MRE11基因的细胞中，Dna2 / Sgs1或Exo1介导的远程剪切以相同的速率发生，但是在起始剪切时存在延迟。;1.Dna2和Sgs1之间也有相互作用，所以由Dna2-Sgs1-RPA催化的切除可能是协调一致的过程，Sgs1介导的解旋和Dna2介导的剪切同时发生； 2.Sae2蛋白可以与MRX一起完成初始位置大约几百个bp的剪切，但是更远处的剪切依赖于Dna2和Sgs1或者Exo1； 3.正常的剪切体系是可以剪切到28kb距离的，所以文献中将Sgs1???Dna2替换成Srs2和Fen1后无法剪切Fen2（28kb),说明远距离剪切失效了，而近距离剪切MAT（0kb）本身由MRX和Sae2就可以实现； 4.过表达RAD27可以起到抑制Dna2-1突变体对于处理冈崎片段的缺少作用，但是对于处理Dna2Δ造成的剪切失效并没有用。 ;Petr