[农学]蛋白质2.ppt

肽 蛋白质肽链结构学说的证据： （1）蛋白质水解前后的结果分析。 （2）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽键连接的。 （3）天然蛋白质有双缩脲反应。 （4）人工合成的聚合aa的X-光衍射谱和红外光谱与天然纤维蛋白相似。 （5）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的正确性。 ? 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 肽的酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形式存在。 肽的酸碱性质主要取决于N端a-NH２和C端a-COOH以及侧链R上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。 肽的化学反应 肽的a-羧基，a-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。 双缩脲反应 (1)　样品必需纯（97%以上）； (2)　知道蛋白质的分子量； (3)　知道蛋白质由几个亚基组成； (4)　测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 (5)　测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 (2) 拆分蛋白质分子的多肽链 如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分。 如果是寡聚蛋白质，多肽链(亚基)是借助非共价相互作用缔合的，则可用变性剂如8 mol／L尿素，6mo1／L盐酸胍或高浓度盐处理，就能使寡聚蛋白质中的亚基拆开。 如果多肽链间是通过共价二硫桥交联的，则可采用氧化剂或还原剂将二硫键断裂。 (3) 断开多肽链内的二硫桥 多肽链内半胱氨酸残基之间的S-S桥必须在进行第4步前予以断裂。 (4) 分析每一多肽链的氨基酸组成 经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸各种残基的数目。 (5) 鉴定多肽链的N—末端和C—末端残基 多肽链的另一部分样品进行N—末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。 (6) 裂解多肽链成较小的片段 用两种或几种不同的断裂方法(指断裂点不一样)将每条多肽链样品降解成两套或几套重叠的肽段或称肽碎片。每套肽段进行分离、纯化。 (7) 测定各肽段的氨基酸序列 目前最常用的肽段测序方法是Edman降解法，并有自动序列分析仪利用。此外尚有酶解法和质谱法等。 (8) 重建完整多肽链的一级结构 利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠可以拼凑出完整多肽链的氨基酸序列。 (9) 确定半胱氨酸残基间形成的S--S交联桥的位置 N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 ③ 苯异硫氰酸酯(PITC)法 Edman （苯异硫氰酸酯法）法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。实际上也是一种氨基酸顺序分析法。 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 实际测定时有困难，很难判断出哪个残基在前，哪个残基在后。 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 二硫桥的断裂 归结起来主要是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。使用最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理(pH 8～9，室温下放置数小时)，可以使S-S定量还原为-SH。与此同时反应系统中还需要有8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在，使蛋白质变性，多肽链松散而成无规则的构象，这样还原剂才能作用于原来处在分子内部的二硫键。然后用烷基化试剂如碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸残基上的-SH，以防止它重新被氧化。 氨基酸组成的分析 待测样品经酸水解，同时辅以碱水解后，用氨基酸分析仪进行测定。仅需6ug样品，时间不到1 h。 蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中