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实验目的 观察底物浓度对酶促反应速度的影响 观察抑制剂对酶促反应速度的影响 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值 底物 酶 底物分子与酶的中心结合 活性中心 催化反应，底物转化为产物 实验原理 酶促反应模型 酶促反应特点 1、酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调节性。 反应体系的条件必须严格控制。 2、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的化学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较。 反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量来确定。 酶促反应速度的影响因素 温度(最优温度) pH (最优pH) 酶的浓度 底物浓度 抑制剂 激活剂 实验对象：碱性磷酸酶（AKP） 磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 苯酚＋磷酸氢二钠 4-氨基安替比林 ＋ K3Fe（CN）6 醌衍生物（红色） 碱性条件 一、pH对酶促反应速度的影响 碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。 二、温度对酶促反应速度的影响 碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37℃。 三、底物浓度对酶促反应速度的影响 ——碱性磷酸酶米氏常数的测定 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ 米-曼氏（Michaelis-Menten）方程： Vmax V [S] Km Vmax/2 米氏方程变换，将曲线作图改为直线作图，可更易利用图解法得Km和Vmax Lineweaver-bulk (林-贝氏）方程 米-曼氏方程 米-曼氏方程曲线 林-贝氏（双倒数）作图法 四、抑制剂对酶促反应的影响 酶的活性下降但不引起酶变性的物质 竞争性抑制作用 竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶和底物的结合 抑制剂↑ 无抑制剂 1/V 1/[S] 特征曲线 Vmax不变，Km变大 非竞争性抑制 抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合，不影响底物和酶的结合，底物与抑制剂之间没有竞争关系 抑制剂↑ 1 / V 1/[S] 无抑制剂 特征曲线 Vmax降低，Km不变 反竞争性抑制 抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量下降，既减少了中间产物转化为产物的量，也减少了从中间产物解离出游离酶和底物的量。 抑制剂↑ 1/V 1/[S] 无抑制剂 特征曲线 Vmax降低，Km降低 本次实验方案 本实验以磷酸苯二钠为底物，碱性磷酸酶AKP为催化剂，磷酸氢二钠作为抑制剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度与酶促反应速度之间的关系 醌衍生物为红色，根据红色深浅测出光密度值，计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示），以1/V-1/S双倒数作图，获得Km值
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