6 第六讲1 分子杂交.pptVIP

核酸分子杂交Nucleic Acid Hybridization 1 分子杂交概念及应用 分子杂交： 在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小。 分子杂交实质上是DNA或RNA单链之间退火形成DNA/RNA或DNA/DNA杂合分子。 应用范围： 重组子鉴别 基因分离 DNA片段分析 基因表达研究 。。。。。。 当用一个标记核酸分子与核酸样品杂交，便可以查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的分子。 2 探针的概念及其标记技术 2.1 探针(probe): 用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸。 2.2 探针的标记技术 2.2.1 均匀标记 2.2.2 末端标记 2.2.1 均匀标记 ⑴ 切口平移法标记 ⑵ 随机引物标记 ⑶ PCR扩增标记 要求： [a-32P]dNTP 2.2.2 末端标记 ⑴ DNA片段的末端标记 Klenow酶 3’-末端补平(3’-末端标记) 5’-ACGTTGCAAACTG-3’ 3’-TGCAACGTTTGAC-5’ T4 DNA polymerase T7 DNA polymerase T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) ⑵ 合成寡核苷酸的标记 T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 3 分子杂交技术 根据检测对象的不同： Southern 杂交 Northern杂交 Western杂交 斑点杂交 狭线杂交 菌落杂交 1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温·迈勒·萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。 Southern 杂交操作步骤： ⑴ 印迹转移(blotting) 将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。 印迹转移方式(1) ——毛细管渗吸法 ⑵ 分子杂交 ① 预杂交 目的：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附 。 预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，其中主要含有鱼精DNA、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。 ② 杂交 在一定的溶液和温度下，将标记的探针与滤膜混合； ⑶ 洗涤 25℃ 1×SSC/0.1%SDS 杂交温度 0.25×SSC/0.1%SDS ⑷ 放射性自显影或生化检测。 Southern杂交的主要应用： 判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。 3.2 Northern杂交 3.3 Western杂交 印迹转移的是蛋白质。 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应鉴别滤膜上的蛋白质。 探针:针对某一蛋白质制备的特异性抗体。 以上分子杂交可以获得精确的结果，但操作繁杂。 当样品量比较大时，难以满足试验需求。 当样品量比较大时，可以采用简化的方式做初步的检测，然后再对阳性样品作精确的检测。 3.4 菌落杂交 基本操作步骤： ⑴ 将细菌菌落影印到滤膜上； ⑵ 对滤膜上的菌体做原位裂解使DNA释放处来，并固定在滤膜上； ⑶ 分子杂交。 用途：从质粒或黏粒载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，然后Southern杂交进一步筛选。 3.5 噬菌斑杂交 基本操作步骤： ⑴ 将噬菌体基因组文库影印到滤膜上，使噬菌体中的DNA释放并固定在滤膜上。 ⑵分子杂交