医学分子生物学_第三部分_基因诊断与基因治疗教材教学课件.ppt

第三部分 基因诊断与基因治疗; 一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常，对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。;基因诊断的特点;二、基因诊断技术平台;Southern印迹杂交法;组织原位杂交  tissue in situ hybridization;*;*;（七）等位基因特异性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR) 基本原理：针对等位基因的序列差异区域设计引物，使引物的3’端与等位基因序列的差异碱基对应，使之仅能与突变型或者野生型互补，从而只能扩增出突变型或者野生型的基因。; PCR技术和其他技术联合使用 PCR－RFLP Restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 PCR－ASO allele-specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸杂交 PCR－SSCP （single-strand conformation polymorphism analysis,SSCP) 单链构象多态性分析 ;DNA测序 DNA芯片 基础：反向点杂交 特点：高通量;三、常见的基因异常及其检测;1 点突变的检测（少量nt缺失和插入） 已知点突变 ① PCR – ASO 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法： (a11ele-specific oligonucleotide hybridization, ASO) 设计ODN探针， 一般合成2个寡核苷酸探针，分别与野生型基因、突变型基因序列互补。　 　 提DNA样品，点样，变性、杂交，严谨条件下洗膜。 分析： 正常序列―正常探针杂交 变异序列―异常探针杂交 两个探针均能够杂交―杂合子，表明同时具有正常序列和变异顺序。 PCR-ASO;;野生型; A ; ② 如突变发生在限制性内切酶的识别位点上，则产生限制酶片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphisms, RFLP） 序列多态性:?限制酶酶切位点的多态性  DNA 酶切 电泳 分析 ;例：Lener视神经病，11778位G A，使SfaN 1酶切点丧失。 DNA PCR SfaN 1酶切 电泳 分析 正常： 190bp, 150bp 杂合子： 190bp, 150bp， 340bp 纯合子： 340bp ;③ 引物特异 PCR 等位基因特异性扩增 (allele specific amplification??ASA) 根据已知突变位点，在引物3’端设计一个错配碱基，使之只与突变型或野生型DNA互补，只扩增突变型或野生型基因。 ? 正常引物，异常引物 PCR　　电泳 分析;④ PCR－测序（检测单点突变、多点突变）;2、未知点突变的检测 及少数nt缺失或插入： PCR-SSCP 将PCR产物经变性后进行DNA（单链）电泳，靶DNA中若发生点突变，会出现泳动变位，而检测。 在PCR-SSCP基础上，测序。;;;3 大片段的缺失（或插入）;三种常见α珠蛋白基因缺失突变（- -SEA, -α4.2和-α3.7）的Gap-PCR产物电泳结果 A： 检测- -SEA 缺失突变的PCR产物电泳结果， 1～2 为- -SEA缺失阴性结果；3～6均为--SEA缺失杂合子样本的PCR产物电泳结果。 B： 检测-α4.2 缺失突变的PCR产物电泳结果，2，7，8为-α4.2缺失阳性结果，其它为阴性结果。 C： 检测-α3.7 缺失突变的PCR产物电泳结果，8为-α3.7缺失阳性结果，其它均为阴性结果。M, 100bp Ladder DNA Marker，D015-21北京鼎国.;4. 基因重排和移位的检测;（二）基因表达异常的诊断 ;图12 RT-PCR检测PKCαASODN转染A549细胞48h对PKCαmRNA表达的影响 (a)