生化实验4动物肝脏DNA的提取和鉴定.ppt

实验五  动物肝脏DNA的提取和鉴定 (教材110页) 一．原理 　DNA 、 RNA在细胞内多以核蛋白体形式存在---DNP 、 RNP．　　分离提取核酸时首先要破碎细胞去除蛋白质和其他物资, 用0.14mol/L Nacl(含柠檬酸钠)匀浆液溶解细胞中的RNA及其他物资,离心，去上清,然后加入提取液（十二烷基硫酸钠，SDS）溶液溶解DNA，然后加入氯仿-辛醇，以去除其余核蛋白和杂蛋白．再离心除去沉淀(杂蛋白)部分,收集上清部分(DNA).　　 最后加入９５％的冷乙醇使DNA析出．　　 将提取得到的DNA放在滤纸上,将液体吸干,将其置于试管内,加入3毫升硫酸进行酸水解，进而分三份，分别对其脱氧核糖、嘌呤碱、及磷酸进行鉴定。 1、脱氧核糖的鉴定 脱氧核糖在酸性溶液中加热(水浴箱加热)能与二苯胺作用生成蓝色化合物  2、嘌呤碱的鉴定 嘌呤碱与AgNO3在碱性环境中作用可产生褐色的嘌呤银化合物。  3、磷酸的鉴定 在酸性条件下，磷酸与钼酸铵作用可产生黄色磷钼酸铵沉淀，磷钼酸铵在抗坏血酸、氯化亚锡等物存在下可被还原成钼兰（蓝色）。二．器材与试剂1、器材（1）培养皿（2）手术剪刀（3）电动组织捣碎机 （4) 离心机 (5) 普通光学显微镜 (6) 冰箱 (7) 具塞离心管 (8) 弯头滴管 (9)小 烧杯 (10) 紫外分光光度计 (11)分析天平 (12)恒温水浴 (13)硬质玻璃试管 (14)新鲜猪肝脏 (15)冰块 2. 试剂 （1）匀浆液（ 0.1 mol/L NaCl ＋0.05 mol/L柠檬酸钠混合盐）  （2） 提取液（ SDS 2mMOL/L溶液）  （3）氯仿：辛醇溶液 （4）无水乙醇（置冰箱中冷却） （5）H2SO4溶液 （6）二苯胺溶液溶液 （7）NAOH溶液 （8）AgNO3溶液 (9)钼酸胺－溶液  （10）Vc---氯化亚锡溶液 三．操作步骤 取鸡肝2.5克，用剪刀剪碎，置乳钵（或匀浆器）中研磨5分钟，加匀浆液5ml，进一步研碎，倾入离心管离心（3500r.p.m ╳10 ),弃上清（RNP部分）， 加入提取液2.5ml，混合均匀，振摇8分钟，加入4.0ml氯仿-辛醇溶液，继续振摇8分钟，离心（3500r.p.m ╳ 15), 吸出上清（约3ml)于一小烧杯，加入二倍体积的95%冷乙醇溶液（边加边用玻棒轻搅）缠出DNA纤维，将其置于滤纸上吸干多余的液体。将DNA置于试管中加入3.0ml硫酸溶液，水浴箱加热15分钟，促其溶解，以备鉴定。 鉴定: 脱氧核糖的鉴定 1.O ml DNA溶解液+二苯胺 加热10分钟 生成蓝色化合物. 嘌呤碱的鉴定 1.0ml DNA溶解液 + 1.0ml NAOH+1.0mlAgNO3---------产生褐色的嘌呤银化合物。 磷酸的鉴定 1.0ml DNA溶解液 +2,0ml溶液钼酸铵溶液---------产生黄色磷钼酸铵沉淀，磷钼酸铵在抗坏血酸、氯化亚锡等物存在下可被还原成钼兰（蓝色）。 四．现象及解释；五．结果与讨论： 六．注意事项 １．每步操作中都注意将离心管内容物充分混匀，以保证提取效果． ２．冷乙醇的作用是使DNA充分析出，乙醇须置于零上４０C充分冷却． ３．离心过程中要特别注意离心机使用方法，注意事项如下： （１）位置对应的离心管离心前必须在普通天平上平衡。  （２）离心时，离心机的机盖必须盖严，由低到高慢慢调速．  （３）停止离心时，须先行关闭电源，待离心机确实停止转动，  方可打开离心机的机盖． * * 1、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP