06 拉曼光谱及其在生命科学中的应用（Raman）.ppt

Pezolet等1976年提出一种根据酰胺Ⅲ带和酰胺I带的拉曼谱峰位置和强度来估算蛋白质二级结构的方法，Lippert等在1976年也提出了一种方法： C蛋白I蛋白1240=f?I?1240+f?I?1240+fRIR1240 (酰胺Ⅲ) C蛋白I蛋白1632=f?I?1632+f?I?1632+fRIR1632(酰胺Ⅰ) C蛋白I蛋白1660=f?I?1660+f?I?1632+fRIR1660 (酰胺Ⅰ) f?+f?+fR=1 显然，其中f?、f?、fR分别为α螺旋、β折叠和无规卷曲这三种结构在蛋白中所占比例， I蛋白1240、I蛋白1632和I蛋白1660是样品在这几个频率处的强度，而I?ν、I?ν和IRν是根据多聚赖氨酸不同的二级结构定下来的，C蛋白是根据蛋白质中亚甲基峰的相对强度进行标定得到的一个比例因子(标度因子)。 * 拉曼光谱法简介 拉曼光谱是分子振动光谱的一种，它属于散射光谱。 拉曼散射效应是1928年印度科学家拉曼发现的。 拉曼光谱与红外光谱在化合物结构分析上各有所长，可以相辅相成，更好地研究分子振动及结构组成。 1. 拉曼散射 用单色光照射透明样品，大部分光透过而小部分光会被样品在各个方向上散射。 散射分为瑞利散射与拉曼散射两种。 1.瑞利散射 ：若光子与样品分子发生弹性碰撞，即光子与分子之间没有能量交换，光子的能量保持不变，散射光频率与入射光相同，但方向可以改变。这是弹性碰撞，叫瑞利散射。 * 2.拉曼散射： 当光子与分子发生非弹性碰撞时，产生拉曼散射。 处于振动基态的分子在光子作用下，激发到较高的不稳定的能态（虚态）后又回到较低能级的振动激发态。此时激发光能量大于散射光能量，产生拉曼散射的斯托克斯线，散射光频率小于入射光。 若光子与处于振动激发态（V1）的分子相互作用，使分子激发到更高的不稳定能态后又回到振动基态（V0）, 散射光的能量大于激发光，产生反斯托克斯散射，散射光频率大于入射光。 * υ0+Δυ υ0 υ0-Δυ 反斯托克斯散射 瑞利散射 斯托克斯散射 拉曼散射机制图示 * 常温下分子大多处于振动基态，所以斯 托克斯线强于反斯托克斯线。在一般拉曼光谱图中只有斯托克斯线。 拉曼散射中散射线频率与激发光（入射光）频率都有一个频率差+??或-??。??叫拉曼位移，其值取决于振动激发态与振动基态的能级差，??=???h。 同一振动方式产生的拉曼位移频率和红外吸收频率是相等的。 拉曼光谱图纵坐标为谱带强度，横坐标为拉曼位移频率，用波数表示。 * * 3.拉曼选律 只有产生偶极矩变化的振动是红外活性的，即红外光谱谱带强度正比于振动中原子通过它们平衡位置时偶极矩的变化。 拉曼活性取决于振动中极化度是否变化，只有极化度有变化的振动才是拉曼活性的。 * 所谓极化度就是分子在电场（如光波这种交变的电磁场）的作用下分子中电子云变形的难易程度。拉曼光谱强度与原子在通过平衡位置前后电子云形状的变化大小有关。拉曼谱线强度正比于诱导偶极矩的变化。 在分子中，某个振动可以是既是拉曼活性，又是红外活性；也可以是只有拉曼活性而无红外活性，或只有红外活性而无拉曼活性。 如CS2是三原子线形分子，它有3n-5=4个基本振动。 * υ1 υ2 υ3 υ4 在υ1s 中偶极矩不变，故非红外活性，但电子云形状变了，故是拉曼活性的。 υ2as和υ3、υ4是红外活性的，而非拉曼活性,因为在平衡位置前后电子云形状相同。 拉曼活性 红外活性 红外活性 * 4 .拉曼光谱的特征谱带及强度 在拉曼光谱中，官能团谱带的频率与其在红外光谱中出现的频率基本一致。不同的是两者选律不同，所以在红外光谱中甚至不出现的振动在拉曼光谱可能是强谱带。 1.相互排斥规则：凡有对称中心的分子，若红外是活性，则拉曼是非活性的；反之，若红外为非活性，则拉曼是活性的。如O2只有一个对称伸缩振动，它在红外中很弱或不可见，而在拉曼中较强。 2.相互允许规则：一般来说，没有对称中心的分子，其红外和拉曼光谱可以都是活性的。例如水的三个振动υas、υs和δ皆是红外和拉曼活性的。 * 3.相互禁阻规则：有少数分子的振动在红外和拉曼中都是非活性的。 如乙稀的扭曲振动既无偶极矩变化， 也无极化度变化，