第五章细胞生物学检测技术1.ppt

第五章 细胞生物学检测技术 韶关学院 易道生 内容 掌握各种细胞形态观察法的原理与操作方法 掌握MTT方法的原理与操作方法 熟悉免疫细胞化学检测技术的原理与操作方法 了解放射性掺入法和流式细胞法的原理与应用 第一节 细胞形态观察技术 自20世纪建立细胞培养技术以来，培养技术和培养基成分不断改进，已经广泛用于现代生物学研究和生产的各个领域，如形态研究、医学领域、兽医研究、遗传研究、生物制药等。 利用细胞培养可以在体外研究药物作用机理、有效剂量，对细胞形态结构、生理机能和代谢的影响。 本章用于以细胞为载体的研究中，通过观察细胞形态和机能变化，为判断效应分子的作用，提供依据。 第一节 细胞形态观察技术 细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样，且体型微小，要对细胞进行研究，需借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。通过观察形态可以检测药物对细胞的作用。 细胞可直接观察、染色观察；可用光镜、荧光显微镜法和电镜法等观察。 常见的观察方法有： 一、显微镜直接观察 显微镜是观察细胞形态结构的主要工具，按照光源不同，分为光学显微镜（可见光/紫外光）和电子显微镜（电子束）。 （一）、光学显微镜 1、相差显微镜（PCM） 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 应用：观察未经染色的标本和活细胞。 操作步骤： 1、打开光源 调整相差聚光器的位置和物镜放大倍数。目镜换成普通望远镜，使视野中2个大小一样的光环重合。 2、观察瓶皿准备 表面搽干净，放入目镜台。 3、调光 调节光强度、光轴，使视野照明均匀。 4、调焦与摄影 使视野图像最清晰，拍照。 观察时以观察目镜为准，照相以摄影目镜为准。 \\\\\\\\\ 一种介壳虫的染色体（PCM照片） 2、荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 3、 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 4、 暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。 5、偏光显微镜 是研究具双折射性物质的主要仪器，如纤维、染色体和透明矿物等。与一般的生物显微镜相比，最主要的区别是有两个偏光镜。其中，一个安装在载物台之下，称下偏光，另一个安装在载物台之上的镜筒中，称上偏光。在偏光显微镜中，上偏光的振动方向是固定的，而下偏光的振动方向是可以调节的。一般来说，两个偏光的振动方向是相互垂直的。 偏光显微镜 镜臂、镜筒、镜座、 反光镜、下偏光镜、 锁光圈、聚光镜、载物台、 物镜、目镜、 上偏光镜、勃氏镜、 粗调螺丝、细调螺丝、 附件等 6、 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 1952年，日本的Nomarski发明。能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。 尼康E800荧光DIC显微镜 DIC显微镜下的硅藻 （二）、活细胞染色方法 染色为便于观察 1、中性红染色 使用0.01%浓度，高压灭菌后暗处保存。 活细胞——红色；死细胞无色。 2、结晶紫染色 使用0.1%浓度，对死活细胞均着色。可用于总细胞计数。 3、台盼蓝染色法 制备单个细胞悬液：105～106／ml 0.4%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）］×100 二、细胞固定观察法 固定法是以一定的化学物质的溶液（有时是气体）在尽可能保持细胞生活结构