(精选)【医学课件】 实时荧光定量PCR技术与应用教学课件.pptVIP

实时荧光定量PCR技术与应用;提纲;PCR概念;;;PCR 循环;常规PCR;提纲; SYBR Green 1;SYBR Green I;SYBR Green I 工作原理;;;;与传统PCR的比较;Melt Curve Analysis;Melt Curve Analysis;SYBR Green I 优点;SYBR Green I 缺点;TaqMan;TaqMan;;;;;TaqMan优点;TaqMan缺点;兼容化学试剂总结;荧光曲线;定量原理;定量原理;定量原理;提纲; 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 ΔCt方法 ΔΔCt方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因）;借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量 得到未知样品初始量绝对值; ΔCT 法相对定量 无均一化处理 均一化依赖于加样的一致性;相对定量——ΔΔCT;Simple; 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 ; 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度;利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化;45oC;实时荧光定量PCR应用;定量PCR应用I-实时定量;定量PCR应用II：终点读板;感谢各位光临！