(精选)【医学课件】抗肿瘤药物评价技术教学课件.pptVIP

抗肿瘤药物评价技术 南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025 025抗肿瘤药物药效学指导原则 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则 化学药物一般药理学研究技术指导原则 中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则 指导原则 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。 试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效 体外实验选用10-15株人癌细胞株 ，至少重复一次 2 3 抗肿瘤药物药效学研究的要求 体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主 1 南京凯基生物科技发展公司 联系电话：025 025体外抗肿瘤活性试验 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考 试验目的 体外抗肿瘤活性试验 试验方法 选用10-15株人癌细胞株 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响 使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。 试验至少应重复一次 四氮唑盐还原法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm波长处检测OD值。 观测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值×100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。 集落形成法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。 方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。 观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。 集落形成率=集落数/细胞接种数X100% 集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100% 生长曲线测定法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 。 方法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算。 观测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 细胞生长饱和密度（N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。 体外抗肿瘤活性试验 白血病（6株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR 肺癌（9