引物设计1003.ppt

引物设计方法 2010 11 23 主要内容 1、引物设计原则 2、本实验室常用引物 引物设计原则 首先、引物与模板的序列要紧密互补， 其次、引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构， 再次、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 3、引物长度 一般在15-30碱基之间,常用的是18-25 bp，引物过短（≤15bp）会影响到扩增的特异性,过长会影响扩增速率，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应，同时，长引物更易于形成包括发卡结构、二聚体、自身互补等二级结构，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。 4、G+C含量 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。 5、碱基要随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6、引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合，若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7、引物之间 两引物之间不应有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠，以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8、引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。 9、引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10、引物3′端要避开密码子的第3位 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 引物设计方法 1、SSR引物设计 2、内含子引物设计 3、caps引物设计 4、其它 SSR引物设计 首先找到你所参考的玉米基因组序列 /genomes/maize DNAStar SeqBuilder Open Edit Copy As Plain Sequence CATCTTTGTAGAAGAATGTGTTGCATGATTATAAGCAAACTCAACATGAGGTAAGCAATCCTCCCAACGTTTCAAATTTTTGTCTAAAACAGCCCTAAGCATGGTAGACAGAGTTCGATTAACTACCTCAGTTTGACCATCAGTCTGAGGGTGACAAGTGGTGCTAAACAGCAATTTAGTTCCTAATTTATTCCACAGAGATCTCCAAAAATGACTCAGAAACTTGGCATCACGATCCGAGACTATTGTATTGGGAATACCGTGCAAACGAATAATCTCTCTAAAAAAACAATTCAGCAACATTGCTAGCATCATCAGTCTTATGACAAGGTATGAAATGAGCCATTTTGGAGAATCGATCAACAACCACAAAAATGCTATCCCTCCCCTTCTTAGTTCTAGGCAATCCCAAAACAAAATCCATCGAAATATCAATCCAAGGGGAAGTAGGAACAGGCAAAGGCATATACAAACCATGGTTGTTCAACCGTGACTTAGCTTTCTGACAAGTAGTGCAGCGTGCAACAAGGCGCTCAACATCAGCGCGCATCCGAGGCCAAAAGAAGTGGGCAGCCAACACCTCATGTGTCTTGTAGATGCCAAAGTGCCCCATGAGACCGCCTCCATGTGCTTCCTGTAACAACAAAAGACGAACCGAGCTAGCTAGAACACACAGCTTGTTAGTGCGAAACAGGAACCCATCCTGTATGTGAAA