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酶免疫测定技术 广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇 概述 1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术 2 标记免疫技术的分类： ⑴按标记物分类：同位素标记 荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术 免疫测定技术 酶免疫测定技术 概述： 1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。 2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法 异相法 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法 则需分离后测定 均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术): 2.克隆酶供体免疫测定 ： 位阻 ED ED EA EA ED Ab Ab 活性酶 标本中Ag 酶联免疫吸附试验(ELISA) 第一节ELISA的原理和类型 一、基本要求： 1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。 免疫吸附剂 2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。 酶结合物 3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应。 底物 二、必备试剂： 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag----结合物 酶反应的底物-------底物 三、方法类型： 夹心法 间接法 竞争法 捕获法测IgM抗体 标本 标本 酶标抗体 底物 显色 有色为阳性 显色 有色为阳性 酶标二抗 底物 3.竞争法 Ag ※ Ag※Ab + Ab Ag(标本) (定量) AgAb E E 终止液 标本 酶标抗体 底物 显色 显色 固相 固相 标本 酶标二抗 底物 1.夹心法 2.间接法 ㈡ 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2. ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm) 四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黄色) α-萘酚(红色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(红色) 4-氯-1-萘酚(灰蓝色) AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 ?-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-?-半乳糖苷：荧光 4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法 二、反应条件的选择 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标二抗，取OD=0.8者。 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 温度、时间等 三、操作标准化 1 加样 2 保温 3 洗涤 4 比色 四、影响ELI