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* 实验一 哺乳动物细胞的培养、冻存和融合 一、实验目的 1、掌握细胞培养过程中的无菌操作的基本要求,掌握哺乳动物细胞原代培养的基本程序。 2、熟练原代培养细胞的代培养和观察方法。 3、掌握细胞冻存的方法,熟练进行细胞冻存与复苏操作。 4、了解细胞融合的基本原理,掌握PEG诱导细胞融合的基本技术。 二、实验材料、试剂与器材 1、材料:胎鼠或新生小鼠;公鸡静脉血。 2、试剂:1640培养基(含10%小牛血清);0.25%胰蛋白酶;0.85%生理盐水;Hank’s液;碘酒;酒精;DMSO;Alsever溶液;GKN溶液;50%PEG溶液;双蒸水等。 3、器材:CO2培养箱;培养瓶;青霉素瓶;小玻璃漏斗;平皿;吸管;移液管;纱布;手术器械;血球计数板;离心机;水浴箱;倒置显微镜;培养箱;超净工作台;冰箱;液氮罐;冻存管;注射器;微量加样器等。 三、实验原理 动物细胞的原代培养也称初代培养,是直接从动物体得到组织细胞后在体外进行的首次培养。从动物体内取出所需的组织,经酶消化处理,使分散成单个游离的细胞,在人工条件下培养,使其不断地生长繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。虽然原代培养是获取细胞的主要手段,但原代培养的组织由多种细胞成分组成,比较复杂。即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或上皮样细胞,细胞间也有很大差异。原代培养的最基本和常用的有两种方法:组织块培养法和消化培养法。 (2)剪切:去除胎儿头、尾及内脏,只留下胎儿四肢及躯干部分,在Hanks液内洗2~3次去除血污后,放入60mm培养皿或青霉素小瓶内,用眼科剪将小鼠胎儿剪成1mm3的小块。 (3)接种:用剪去尖头的枪头吸取若干小组织块,置于培养瓶中,均匀地铺展在培养瓶底部,调整小块之间的相互距离,每25ml培养瓶可接种20~30小块。 (4)粘附培养:组织块布置好之后,稍微倾斜培养瓶,使瓶内的液体倾至培养瓶的一角,吸出瓶中的培养液,轻轻地将培养瓶翻转,让接种组织块的瓶底面向上。盖好瓶盖,将培养瓶放置于CO2培养箱内37℃培养2~4小时,使组织块粘着在培养瓶底上。 (5)培养:从培养箱中取出培养瓶,开盖,瓶底朝上,从瓶底角部加入1ml DMEM+10%~20%FBS+抗生素的培养液,然后缓慢翻转培养瓶,让培养液覆盖附着于瓶底的组织块,放置培养箱中培养,待细胞从组织块游出数量较多时,再补加培养液至约3ml。注意培养过程中需拧松培养瓶盖,以利空气通过。 在翻转培养瓶和加液过程中,动作一定要慢,勿使组织块受到冲击漂浮起来。若组织块不易贴壁,可预先在瓶壁涂上薄层、胎汁或鼠尾胶原等。 组织块培养也可以不用翻转,即在接种组织块后,向瓶内仅加入少量的培养液,以能保证组织块湿润即可,放入培养箱内24小时再补加培养液。 2、消化培养法: (1)取材与剪切:同组织块培养法。 (2)消化:将剪切后的组织小块移到10ml离心管内,加2ml的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA组成的消化液,室温下消化5~20min,期间吹打数次,并随时吸取少量的消化液在显微镜下观察,如发现组织已分散成细胞团或单个细胞,则立即加入8ml含5%FBS的Hanks液终止消化。 (3)用吸管反复吹打组织块,分散单细胞,用100μm不锈钢网筛过滤,收取滤出液,1000r/min离心10min,弃上清。 (4)用2ml DMEM+10%FBS培养液悬浮细胞,计数并稀释细胞浓度至(1~5)×106/ml,每个培养瓶加细胞悬液2.5ml,使细胞数<1×105/cm2。置CO2培养箱,37℃、5%CO2、饱和湿度下静置培养,24小时后,更换新培养液,此后每3天换液1次 。 组织块培养游离出单个细胞×100 成纤维细胞汇合呈旋涡状×100 【实验结果与分析 】 1、观察和记录原代细胞的形态、培养细胞的贴壁时间、增殖时间、完全汇合时间。 2、比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。 【思考题】 1、观察原代培养细胞中的细胞类型,并根据以往的知识初步分析哪些细胞属于成纤维细胞,哪些属于上皮样细胞? 2、如何提高原代细胞培养的成功率? (二)动物细胞传代培养 【实验步骤】 1.将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2.加入0.5-1ml 0.25%胰蛋白酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。 3.瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰蛋白酶弃去,加入10ml培养液终止消化(观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3min)。 4.用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 【实验结果与分析】
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