(精编)【医学教学课件大全】 IEF SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳教学课件.pptVIP

实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳; 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入 了后基因组时代在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能 基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。自从澳大 利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出蛋白质组 (Proteome)这一概念以来,国际上蛋白质组研究进展十分迅速, 不论基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善。相当多种细 胞的蛋白质组数据库已经建立,相应的国际互联网站也层出不 穷。1996年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中 心:Australia Proteome AnalysisFacility(APAF)。丹麦、加 拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国,各大药厂 和公司在巨大财力的支持下,也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。; 国内从1997年开始开展蛋白质组研究，已建立起基本蛋白 质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研 究中心和军事医学科学院。目前年我国的蛋白质组研究进入了 一个迅速发展的新阶段,其主要标志是国家科技部将蛋白质组研 究确立为“973”和“863”的项目。 蛋白质组学一经出现,就有两种研究策略。一种可称为“竭 泽法”,即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能 多乃至接近所有的蛋白质,这种观点从大规模、系统性的角度来 看待蛋白质组学,也更符合蛋白质组学的本质。但是,由于蛋白 质表达随空间和时间不断变化,要分析生物体内所有的蛋白质是 一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”,即研究不同 时期细胞蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达, 以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把 蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。;一、实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺 电泳组合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上 进行第二向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白 质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )； 第二项则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把 复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电??和 质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量 信息。 ;二. 实验步骤; 2） 第一向凝胶储备液（含28.38%丙烯酰胺、1.62%甲叉双 丙烯酰胺）：取7.09g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入0.405g甲叉双 丙烯酰胺。待溶解完全后定容至25ml，置于棕色瓶内于， 4℃冰 箱保存。 3） 第一向电极母液（临用前稀释10倍）： 正电极母液（0.1mol磷酸）：取6.75ml磷酸，用去离子水定 容至1000ml。 负电极母掖（0.2mol NaOH）：取16g NaOH，用去离子水定容 至2000ml。 4）样品覆盖掖（含8.0mol/L尿素、0.4% Ampholine pH5- 7、0.4% Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、5 mmol/L K2CO3）：取新鲜尿素4.8g，0.1ml Ampholine pH5-7， 0.1ml Ampholine pH6-8，0.1mlAmpholine pH3.5-10，1ml 50 mmol/L K2CO3，用双蒸水定容到10ml。用Eppendorf 管分装， 每管100ul，置于－20℃冰箱保存。; 5）平衡液(含10%甘油、5%?-巯基乙醇、2.3g SDS 、0.625mol /LTris- HCI、55ml甲醇)：取10ml甘油、5ml ?-巯基乙醇、0.5ml浓盐酸、2.3g SDS、0.757gTris，先用20ml双蒸水溶解，然后加入55ml甲醇，最后用双蒸水 定容到100ml。置棕色瓶中于4℃冰箱保存。 6）第二向凝胶储备液（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1）：取29g丙烯 酰胺溶于双蒸水后加入1g甲叉双丙烯酰胺，待溶解完全后定容至100ml，置于 棕色瓶内于4℃冰箱保存。 7）分离胶缓冲液（1.5mol Tris-HCI，pH8.8）：取0.86gTris，溶于 400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到8.8，最后定容至500ml。 8）浓缩胶缓冲液（1.0mol Tris-HCI，pH6.8）：取0.56gTris，溶于 400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到6.8，最后定容至500ml。 9）SDS电极贮存液（临用前稀释5倍）：900ml去离子水中溶解 15.1g Tris和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%(w/v)的电泳级SDS贮存液，用 去离子水定容至1