通过花粉管途径将BYDV-GPV株系缺失复制酶基因导入小麦.pdfVIP

农业生物技术学报 根据已经测得的基因组序列，分别合成编码复制酶 序列完奎相同。通过双酶切将目的片段切下，定向 的ORF2基因的上下游引物，上游引物：5’-A1、GA- AAcAcGGTGTAGcGTbG Gc·3’；下游引物：5．- 8(图1)。 表达载体并命名为pPPI TcAGGrrAA丌丌GTGGTG一3。。RT—PCR方法扩增 oRF2基目片段。斯埔T酶切切去31端部分，电泳回 2 牧5’端1134bp的片段。通过平端连接，将片段插 胎口舸I 丘ⅫRI 入到pucl9中。序列测定确定擂入序列和方向正确 后，x蚰T+印nI双酶切，回收目的片段，与同样双 图1用于转化的植物表达载体 酶切的载体质粒pEmu—mcs．N连接，获得用于转化 1 used Fig Expfessionp】asmids 小麦妁植物表达载体。 1_3转化小麦转化所用小麦品种为来自我国西北2．2 地区小麦黄矮病高发区的优良小麦品种晋麦47；转 d以 化所用质粒为双质粒，分别为含有报告基因NPTll 的植物表达载体p35sNEo和含有BYDv—GPv株系 色。将绿苗移裁到花盆中后，部分苗继续变白，最 缺失31端的ORf2基因的植物表达载体pPPl8；转 终实有绿茴27株。 北方法为花粉管通道法：选取刚开始开花的小花用 5～2．0 记号笔进行标记，在o h内用剪刀剪去羽状柱 头，立即滴加10“L含有p35sNEO(】峙)和pPPT 8(5呜)质粒的DNA液，待其自然结实。 1．4 转基因小麦的检测 6个样品表现PcR扩增阳性反应(图略)。 1．4．1 卡那霉素抗性筛选采用蔬菜无土栽培用塑 2．3 料盘，每孔中放置3粒T。代种子，盘中加入含有卡 那霉素(10蜉／mL)的水，置于室温下培养，等非 转基因对照苗全部变白后，将仍保持绿色的转基因 苗移栽到花盆中，转移至温室生长。 1．4．2 PcR检测取卡那霉素检测绿苗叶片，cTAB 法”l提取总DNA。按照转基因片段的两端序列合 成相应引物，进行PcR检测。 扩增带(图2)。 1．4．3 soufhem检测选择PcR检测阳性的转基因 苗．提取总DNA，分别进行双酶切(x妇l+确”1) 和不酶切处理，1％琼脂糖凝肢电泳后，将DNA转 移到硝酸纤维素膜上。采用Pmmega公司PHme·a- Gene。Lab“ngsystem试剂盒和[n一”P]dcTP标记 B丫DV-GPV复制酶基因DNA片段制备成探针，进 行southem杂交分析。 表明转化基因已经整合到转基因植株的染色体中， 1．44 抗病性初步鉴定 检测阳性的转基因苗，接 而不是以质粒的形式游离于植物组织中；双酶切 种GPV株系毒原饲毒的介体蚜虫，每株接】5屯O头， 134 soutllem结果，与l 以保证充分发病。2d后除去蚜虫。等非转基因对照 位置，6个转基因材料均切出了相应的阳性条带，表 植株开始发病时，定期进行观察，并记载发病情况。 明转基因片段是完整的。 2结果与分析 2】 植物表达载体的构建RT—