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畜牧与兽医2010年第42卷第5期 ·55· 质粒介导的siRNA对犬细小病毒复制的影响 贺 英1”，曹旺斌1，夏润玺2，张曼夫2 (I．河北科技师范学院动物科学系，河北秦皇岛066600； 2．中国农业大学生物学院，北京100094) psiSTRIKE系列的U6发卡结构载体，构建了小发夹RNA(shorthairpin 转染细胞后，能够不同程度地抑制病毒在宿主细胞内的复制。因此质粒介导的shRNg能抑制CPV在细胞内的复制和感染，具有抗病毒作用，从 而为进一步通过siRNA途径控制病毒奠定基础。 关键词：犬细小病毒；SiRNA干扰；复制；质粒 中图分类号：$852．4 文献标识码：A 文章编号：0529-5130(2010)05-0055-04 RNA干扰(RNAi)是指短的双链RNA能降解业部兽医诊断中心。 与其互补mRNA，特异性诱发转录后基因沉默的现1．1．2载体和试剂 siSTRIKE 象。这种现象最初报道于秀丽线虫和植物体内，最近 U6发卡克隆系统购自promega公司； 在哺乳动物细胞中也有所发现‘1-2]。RNAi在植物体无内毒素质粒DNA提取试剂盒购白天为时代公司； 内是通过dsRNA特异性的核酸内切酶D池r2尺D应lCPV单克隆抗体由农业部诊断中心孙明教授惠赠； 参与的对感染病毒的自然反应：首先将长的外源 羊抗鼠FITC标记二抗购自中杉公司，碘化丙啶 dsRNA切割成21～25nt的片段(称为短干扰RNA， siRNA)，siRNA再与酶形成蛋白复合物，能够特异 1．1．3 性识别和切割靶mRNA，引发RNAi反应旧J。在哺乳 寡核苷酸 动物细胞内导入2Int的siRNA同样能够引发RNAi效根据病毒基因组分别在非结构蛋白NS基因区设 应【4J，这就为控制动物病原微生物的细胞内复制创 计2对寡聚核苷酸，在结构蛋白VPl区设计l对寡 造了可能性。 聚核苷酸，VP2和VPl共有区设计1对寡聚核苷酸， siRNA能够抑制病毒复制和表达，已有研究者做随机设计1对非特异寡聚核苷酸，由上海生工合成， 了一些工作。9J，多数集中在基因组为RNA的病毒。具体序列见表1。 犬细小病毒(Canine 1．2方法 parvovirus，CPV-2)，属细小病 毒科细小病毒亚科细小病毒属自主复制的单链DNA 1．2．1寡聚核苷酸的设计 病毒。由其引起的犬细小病毒病是犬的一种具有高度 以CPV基因组为模板，首先选择19—23个核苷 接触性的烈性传染病。本试验的目的在于通过在 DNA片段，研 psiSTRIKE系统中插入特异性的CPV 究质粒介导的siRNA对犬细小病毒复制的影响，探聚核苷酸。 索siRNA控制单链DNA基因组病毒的可能性，开辟 抗细小病毒的新途径。 火，进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌JMl09， 1材料与方法 氨苄青霉素筛选阳性克隆，用PstI酶切鉴定插入片 1．1材料 段，筛选阳性质粒。用含有阳性质粒的细菌提取质 1．1．1病毒和细胞 CPV由本实验室分离鉴定，FKSI细胞系购自农 收稿日期：2009-10-24 作者简介：贺英(1969一)，女，副教授，理学博士。 ·56· Animal Medicine2010V01．42No．5 HusbandryVeterinary 表1针对CPV基因组设计的siRNA干扰寡聚核苷酸 寡聚核苷酸