第二代高通量药物筛选平台-PHERAFS.PDF

第二代高通量药物筛选平台更容易发现磷脂酰肌醇信号通路低亲合力抑制剂 EJ Dell1, J L Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1 1 BMG LABTECH Inc. NC, USA edward.dell@ 2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France 关键词：高通量，药物筛选，HTS，HTRF，Cisbio，BMG Labtech，PHERAstar FS ，磷脂酰肌醇信号通路，低亲合 力，抑制剂，G-蛋白偶联受体，GPCRs 摘要: 通过传统的高通量药物筛选平台（HTS ）所发现的可市场化的药物不仅数量少，而且市面上大部分的药物都 是小分子量 （<500Da）物质。这似乎说明，运行于更低体积和更低浓度下的传统高通量药物筛选平台，错失了发 现更低亲合力药物的机会。 市场的需求催生了下一代高通量药物筛选平台——来自德国BMG LABTECH公司的PHERAstar FS ，以光电倍增 管（PMT）检测技术为核心的多功能微孔板检测仪。与来自另一品牌在行业中处于领导地位的以CCD相机为技术 核心的微孔板检测仪进行平行测试。数据显示，PMT微孔板检测仪 （PHERAstar FS ）比CCD微孔板检测仪具有明显 的性能优势：超过2倍的读数速度已经更加卓越的分析质量参数。更重要的是，PMT微孔板检测仪（PHERAstar FS ） 检测出几个CCD检测仪不能发现的更低亲合力的药物“靶点”。PHERAstar FS ，作为新的高通量药物筛选的黃金 标准，将是传统高通量药物筛选中用于发现低亲合力复合物的代表性选择。 数据显示，PMT微孔板检测仪与CCD微孔板检测仪相比： 发现几个更低亲合力的药物“hits ”（活性化合物） 更好的Z’ ，分析窗和ΔF% 2 倍以上的检测速度 实例分析: 在这里，我们采用的是Cisbio 公司生产的IP-One HTRF®分析——该方案检测更低应答的胞内第二信使磷酸肌 醇（IP1），磷酸肌醇是三磷酸肌醇 （IP3 ）的下游代谢产物。我们同时对比了两种不同的高通量筛选微孔板检测 仪 （PHERAstar FS 和来自另外一个品牌的微孔板检测仪）对磷脂酰肌醇信号通路低亲合力抑制剂的检测结果来评 估两种药物筛选技术。 背景知识: G-蛋白偶联受体(GPCRs)为跨膜蛋白，是介导细胞外刺激信号 的关键角色。GPCRs与胞内一系列复杂的复合物相互作用调控非 常大量的下游效应物质。其产物三磷酸肌醇(IP3)是其中一个第二 信使，是对Gq-蛋白偶联受体被激活的应答而产生的。然而，IP3 的半衰期非常短，对于药物筛选而言，是很难对其进行测定的。 因此，对由IP3触发的钙释放的监测，作为该信号通路的下游信号 被广泛应用。另外一个监测IP3的方法是检测磷酸肌醇 （IP1）的累 积，磷酸肌醇（IP1）是三磷酸肌醇（IP3 ）的下游代谢产物。 图1.IP1 的生物合成路径 利用IP1的稳定性和在细胞内的可累积性的优点，采用IP1单克隆抗体制备优化的均相时间分辨荧光 (HTRF®) 分析方法。HTRF® IP-One分析方法已经与多种现存的方法相比较且得到相似的复合效能数据，且在终点累积的IP1 可用于测定缓作用复合物的作用，这个是钙流测定没办法做到的。HTRF® IP-One分析方法同时可通过定量组成性 激活的G蛋白受体来测定反向激动剂，这是测定钙释放的方法所不能做到的。最后一点，HTRF® IP-One检测方法 具有比钙流检测方法更好的分析稳健度和更低的假阳性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其专利HTRF®技术上 开发出来的。 (图2). 该分析方法采用与 IP1 特异性结合的单克隆抗体，其 原理是基于胞内累积的 IP1 与其竞争性结合从而抑制了 HTRF®供体和受体之间的荧光共振能量转移 （FRET ）。建 立一个 IP1 标准校正曲线可用于计算因复合物作用而引起 的胞内累积的IP1 的浓度，从而相应得到了复合物的浓度。