第五章 层析分离技术.ppt

层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。 一、层析的原理 层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。 二、层析的分类 按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析 根据流动相的形式： 液相层析、气相层析 三、层析基本操作过程 1、柱层析的L/d比值 2、洗脱装置 改变溶剂系统 3、结果检测 活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性 结果保存 薄层层析纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理 4、层析装置的仪器化 HPLC 四、层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。 1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 2、等电点沉淀 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 3、有机溶剂沉淀 降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。 一、原理 根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，达到分离目的。 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。 常见的吸附类型及其主要特点 物理吸附： 吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快。 化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。 二、常用吸附剂种类 吸附剂通常应具备以下特征： 对被分离的物质具有较强的吸附能力 有较高的吸附选择性 机械强度高 再生容易、性能稳定 价格低廉。 常用吸附剂 硅胶 氧化铝 聚酰胺 活性炭 大孔吸附树脂 1、硅胶 颗粒表面存在的很多硅酰基作为活性中心与所进行层析的化合物形成强的氢键作用 硅酰基能够通过氢键的形成而吸附水分，并随着吸着的水分增加而降低吸附力 活化 加热至100～110℃，除去硅胶表面因氢键所吸附的水分 当温度升高至500℃时，硅酰基脱水缩合转变为硅氧烷键，不再有吸附剂的性质 再生 一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，110℃烘干活化处理 2、氧化铝 多孔的A1203的聚合物，吸附性能也可通过改 变其含水量加以控制。 酸性氧化铝 pH值约为4.0，分离酸性化合物如羧酸类 碱性氧化铝 pH值约为10.0，分离诸如生物碱类的碱性化合物 中性氧化铝 pH约为7.0，分离相对非极性的化合物如类固醇 活化 200℃左右加温4～6小时 再生 弃去柱顶端的加样部位后，依次用甲醇、稀乙酸、氢氧化钠溶液和水洗涤，再经高温(200℃)活化 3、聚酰胺 尼龙-6：己内酰胺聚合而成 尼龙-66：己二酸与己二胺聚合而成 丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等通过氢键结合而被吸附 对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差 应用：生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非