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第五章 灭菌 主讲：赵俊仁 第五章 灭菌 5.1 灭菌的方法 5.2 培养基的湿热灭菌 5.3 空气的处菌 5.1 灭菌的方法 染菌产生的不良后果： 使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。 灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60℃维持30min,以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 几种常见的灭菌方法 （1）化学药剂灭菌 机理：某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。 常用药剂：甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。 使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌；不能用于培养基灭菌。 （2）辐射灭菌 原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和γ射线。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。 （3）干热灭菌 原理：利用高温对微生物氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140～180℃ 1-2h。 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌。 （4）湿热灭菌 原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 常用方法：水煮常压灭菌，100℃，饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30min。 使用范围：培养基和发酵设备灭菌。 （5）过滤除菌 原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法: 0.01~0.45 ?m孔径滤膜。 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。 5.2 培养基的湿热灭菌 5.2.1 微生物的死亡速率与理论灭菌时间 在培养基湿热灭菌时，其中微生物受热死亡的速率是与残存的微生物数量成正比的。即： N：培养基中的活菌个数； t：时间； k：比死亡速率。 开始灭菌时，即t=0时，培养基中活菌数为N0。 积分上式： 以菌的残留数N/ N0的对数与时间t 在半对数坐标上作图，得出一条直线，其斜率为- k，又称之为灭菌速度常数。 （P122 图5-1） k值越大，微生物越容易死亡。 理论灭菌时间 随着温度的变化，比死亡速率k值有很大变化，温度对k的影响遵循阿仑尼乌斯定律，即 k=A e –E / RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度(K) △E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol） 这样，就得到了只随灭菌温度而变的灭菌速率常数k的简化公式（5－5） 5.2.2 培养基的分批灭菌 （1）定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。 5.2.3 培养基的连续灭菌 定义：将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的基本设备有哪些 ？ 连续灭菌的流程与设备 （1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60～70 ℃ ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； （2）连消塔（加热器），用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126～132℃）； （3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持5～7min。因为连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的; （4）冷却管，使料液冷却到40?50℃后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。 5.3 空气的除菌 5.3.1 发酵用无菌空气的质量标准 空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 ~ 104个／m3。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.6~1μm）。 5.3.2 空气预处理 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 1、提高压缩前空气的洁净度 （1）提高空气吸气口的位置 （2）在空气入口处设置粗过滤器 ——捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机。 高空取气管 为远离地面几十米的管子。 每升高10m，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。 2.空气压缩和压缩空气的冷却 （1）空气压缩：克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。 （2）压缩后空气温度显著上