[农学]松口蘑菌种的分离.ppt

松口蘑菌种的分离、纯化、鉴定及原生质体制备的研究 指导教师： 邹 莉 教授 王志英 教授 答 辩 人： 孟 雪 答辩日期： 2006年12月26日 一、松口蘑概述 二、松口蘑菌丝体分离纯化及鉴定 三、松口蘑菌丝体培养基和培养条件筛选 四、松口蘑原生质体制备 五、结论 六、攻读学位期间发表的学术论文 七、致谢 一、 松口蘑概述 （一）分布特点 松口蘑又称为松茸、松磨、松覃、鸡丝菌等。分布于北半球的亚洲，主要产地是日本、中国、朝鲜、俄罗斯等国家，在中国分布于东北部的黑龙江、吉林、东部的安徽、福建、台湾、北部的陕西以及西部的四川、甘肃、山西、云南、贵州、西藏等省区境内，分布带狭窄，产量低。 （二）食用和药用价值 松口蘑是一种世界性的名贵食用菌，肉质肥厚，香气浓郁，风味独特，素有“菇中之王”的美称。它不仅味道鲜美，营养丰富，而且具有强身健脾，理气化痰的作用，现代医学研究表明，松口蘑可治疗糖尿病，并具有抗癌作用。 （三）松口蘑的驯化前景 　由于松口蘑与寄主是典型的营养共生关系,人工驯化栽培松口蘑存在着很大的困难，一是菌丝体纯培养生长速度缓慢，难以迅速扩繁；二是人工诱发形成子实体较难。为了克服以上困难，应该进一步研究松口蘑与菌根植物的共生机理，为松口蘑营造增殖的营养条件和生态环境；探索松口蘑发育的遗传机理，从基因水平人为控制或调节松口蘑结实基因的即时表达，为松口蘑人工驯化栽培奠定基础。 （四）研究目的和意义 　　我国学者主要对分布在西南及长白山地区的松口蘑进行了较系统的研究，但对黑龙江省松口蘑的研究未见报道。因此本文以黑龙江省东宁县松口蘑为材料，采用组织分离法分离松口蘑菌丝体，得到纯化菌种；通过对松口蘑和分离物形态特征的比较，并利用分子生物学手段对其进行鉴定，从而建立一个难栽培食用菌的鉴定体系；采用不同的培养基、培养温度及pH值，通过生长速度的测定，确定其营养特性和环境因子，为人工栽培创造有力条件；利用原生质体制备技术，制备松口蘑原生质体，为松口蘑原生质体融合奠定理论基础。 二、 松口蘑菌丝体分离纯化及鉴定 1、子实体的采集 ： 在黑龙江省东宁县采集了4个未开伞的松口蘑，编号为1、2、3、4号。 2. 分离培养基： PDA培养基 PDA+VB1+VB3培养基(PVB) BM培养基 BM+VB3培养基 (BMV) 滨田培养基（Bt） Bt+VB1培养基 (BtV) PDA+黑木耳二级种浸出液+麦麸培养基(PWJ) 3. 菌丝体形态鉴定 （1）菌落及菌丝体形态观察 菌丝体在PWJ平板上生长，形成毛刺状菌丝束，随后菌丝体贴培养基缓慢生长。菌落中心突起、草帽状，菌丝边缘呈皱褶状，表面菌丝短粗，具有松口蘑香味。这与以往文献描述的松口蘑菌落形态特征相同。 （2）子实体与分离物显微结构 三、松口蘑菌丝体最佳培养基和培养条件的筛选 1.最佳培养基筛选 （1）筛选培养基 A: PDA培养基 B: 酵母粉培养基 C:磷酸二氢钾+硫酸镁+麦芽糖+葡萄糖 +维生素(B1) +酒石酸氨 D:滨田氏培养基+ VB3 E: PDA+麦麸+黑木耳二级种浸出液培养基 F:滨田氏培养基 G:PDA+VB3 以上培养基均用去离子水配制，pH为5.5。 液体培养基不加琼脂。 2. 松口蘑菌丝体较适pH和较适温度筛选 2. 松口蘑原生质体的制备 （1） 取培养60d的菌丝培养液倒入到无菌离心 管中，离心10min.去掉上清液. （2）用高渗缓冲液MgSO4洗涤2-3次，去培养基。 （3）在无菌条件下以每300mg菌丝加入1.5ml酶液的标准，分别用浓度为1.5%、2.0%、2.5%的溶壁酶和蜗牛酶酶解。 （4）每隔半小时取样观察一次，用血球计数板在显微镜下记下原生质体的个数 。 3. 酶及酶解时间对原生质体产量的影响 采用完全随机试验设计，对影响松口蘑原生质体分离的酶种类、浓度及酶解时间进行组合试验。 1.5%溶壁酶酶解3h时的原生质体 由表可以看出，在酶浓度和酶解时间相同时，原生质体的产量溶壁酶的效果普遍高于蜗牛酶，因此，仅对使用不同浓度的溶壁酶和酶解时间对原生质体产